NOD蛋白在煙曲霉感染小鼠肺組織中的表達(dá)及對(duì)煙曲霉孢子的識(shí)別機(jī)制.pdf

1、煙曲霉(Af)是目前最常見的空氣傳播的真菌感染病原體，可導(dǎo)致免疫受損患者發(fā)生嚴(yán)重且往往是致死性的侵襲性肺曲霉病(IPA)。隨著免疫受損患者的增多，IPA發(fā)病率顯著增加，已成為目前免疫受損患者最常見的肺部感染性疾病之一。在過(guò)去的十余年中，盡管不斷有新的抗真菌藥物問(wèn)世，但由于IPA早期診斷困難且病情進(jìn)展迅速，其病死率仍居高不下。故開展機(jī)體抵御煙曲霉感染的免疫反應(yīng)機(jī)制研究，探索預(yù)防和治療煙曲霉感染的新措施，對(duì)于降低IPA發(fā)病率和病死率具有十分

2、重要的意義。 先天性免疫系統(tǒng)是機(jī)體識(shí)別、抵御病原體感染的第一道防線，它通過(guò)模式識(shí)別受體(patternrecognitionreceptors，PRRs)來(lái)迅速識(shí)別病原體。目前研究最多的PRRs為Toll樣受體(tol卜¨kereceptors，TLRs)，已被證實(shí)與抗煙曲霉感染免疫反應(yīng)有關(guān)。另一類PRRs是近年來(lái)才發(fā)現(xiàn)的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide—bindingo¨gomerizationdomain，NOD

3、)蛋白。NOD蛋白為胞漿內(nèi)蛋白，目前認(rèn)為它們與識(shí)別細(xì)胞內(nèi)病原體有關(guān)。已知的NOD蛋白家族成員有20余種，其中最為重要的是NODl和NOD2。NODl又稱CARD(caspaserecruitmentdomain)一4蛋白，在全身各種組織細(xì)胞中都有分布，識(shí)別主要存在于革蘭陰性菌中的肽聚糖(PGN)的降解產(chǎn)物GM-triDAP。NOD2又稱CARDl5，分布主要局限于上皮細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(APCs)，識(shí)別的最小基序?yàn)榘邗６?MDP)。

4、MDP同時(shí)存在于革蘭陰性和陽(yáng)性細(xì)菌胞壁PGN的降解產(chǎn)物中。盡管NODl和NOD2識(shí)別的配體不同，但它們都是通過(guò)受體相互作用蛋白2(receptor-interactingprotein2，RIP2)來(lái)激活NF-KB信號(hào)通路，促進(jìn)一系列細(xì)胞因子的合成。已經(jīng)證實(shí)NOD蛋白與多種細(xì)菌感染免疫反應(yīng)有關(guān)。 煙曲霉孢子通過(guò)空氣傳播，由于其體積小，可順利進(jìn)入下呼吸道，當(dāng)條件適宜生長(zhǎng)時(shí)便出芽形成菌絲，侵襲組織細(xì)胞，造成組織損傷。肺上皮細(xì)胞及肺泡

5、巨噬細(xì)胞作為肺部先天性免疫的主要組成細(xì)胞，能夠吞噬、殺滅煙曲霉孢子，釋放出一系列炎癥細(xì)胞因子，在抵御煙曲霉感染中發(fā)揮重要作用。已有研究表明PRRs在先天性免疫系統(tǒng)占有重要地位，但迄今為止NOD蛋白在肺組織中的表達(dá)僅有少量研究報(bào)道，尚未見NOD蛋白在抗煙曲霉感染免疫反應(yīng)中作用的研究報(bào)道。鑒于煙曲霉系胞內(nèi)感染病原體，我們假設(shè)NOD蛋白可能為煙曲霉的胞漿內(nèi)PRRs。本研究通過(guò)建立煙曲霉肺部感染小鼠模型及A549、THPl細(xì)胞的培養(yǎng)來(lái)研究肺組織

6、中NOD相關(guān)蛋白的表達(dá)及對(duì)煙曲霉孢子的識(shí)別機(jī)制。 第一部分NOD相關(guān)蛋白在煙曲霉感染小鼠肺組織中的表達(dá) 目的：觀察NOD相關(guān)蛋白在煙曲霉感染小鼠肺部組織中的表達(dá)。方法：60只雄性BALB／c小鼠隨機(jī)分成2組，每組30只。通過(guò)經(jīng)鼻滴入煙曲霉孢子的方法建立煙曲霉肺部感染小鼠模型，對(duì)照組小鼠經(jīng)鼻滴入等量的生理鹽水。分別在感染前(卟)、感染后6h、12h、24h、48h觀察肺部煙曲霉負(fù)荷及病理學(xué)改變。采用RT-PCR方法檢測(cè)各時(shí)

7、間點(diǎn)的NODl、NOD2及RIP2mRNA在肺組織中的表達(dá)。采用免疫組化的方法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)兩組小鼠肺組織NOD2蛋白的表達(dá)。結(jié)果：(1)感染組小鼠肺部煙曲霉負(fù)荷24h達(dá)最高峰，48h迅速下降。(2)兩組小鼠肺組織均表現(xiàn)為支氣管肺泡炎癥為主的病理改變。感染組小鼠24h炎癥反應(yīng)最顯著，48h減輕。對(duì)照組小鼠病理?yè)p害明顯輕于感染組。(3)接種煙曲霉前(0h)、后6h、12h、24h、48hNODlmRNA表達(dá)量分別為0．34±0．05、0．4

8、l±0．08、O．46±0．07、0．47±0．04、0．47±0．48；NOD2mRNA表達(dá)量分別為0．30±0.00、O．36±0．06、0．45±0．10、0．60±O.00、0．73±0．08：RIP2mRNA表達(dá)量分別為0．44±0．10、O．56±O．09、O．62±0．07、0．64±0．07、0．63±0．06。感染后12h、24h、48hNODl、NOD2、RIP2mRNA表達(dá)上調(diào)，同感染前(0h)相比有顯著差異(P<

9、O．05)。NOD2mRNA的表達(dá)上調(diào)比NODl更加明顯。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)NODl、NOD2、RIP2mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異。感染組和對(duì)照組比較除0h、6h外各時(shí)間點(diǎn)NODl、RIP2mRNA表達(dá)均有顯著差異(P<0．05)。除0h外兩組各時(shí)間點(diǎn)NOD2mRNA表達(dá)有顯著差異(P

10、189．58、163854．4±17185．61、341363．9±35102．07、289¨4．5±38424．35，24hNOD2蛋白表達(dá)同0h相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)NOD2蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異。感染組、對(duì)照組組間比較24h、48hNOD2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

11、可能參與了抗煙曲霉肺部感染的免疫反應(yīng)。 第二部分A549、THPl細(xì)胞中NOD2蛋白的表達(dá)與煙曲霉孢子刺激及TNF-α分泌的相關(guān)性研究 目的：觀察滅活煙曲霉孢子刺激人肺泡上皮細(xì)胞株A549及人單核／吞噬細(xì)胞株THPl后細(xì)胞中NOD2蛋白和NOD2蛋白的下游物RIP2激酶的表達(dá)，以及MDP對(duì)Af孢子刺激上述細(xì)胞分泌TNF—a的影響，探討NOD2蛋白在機(jī)體抗煙曲霉感染免疫反應(yīng)中的作用。方法：(1)透射電鏡觀察A549、THP

12、l細(xì)胞與煙曲霉孢子孵育10h、24h、48h后細(xì)胞及胞漿內(nèi)孢子的形態(tài)。(2)Real-timePCR檢測(cè)A549、THPl細(xì)胞在煙曲霉孢子刺激前(Oh)、后24h、48hNOD2、RIP2、TNF-amRNA表達(dá)。(3)Real-timePCR檢測(cè)不同刺激強(qiáng)度的煙曲霉孢子刺激A549、THPl細(xì)胞后NOD2mRNA表達(dá)。(4)免疫熒光法觀察煙曲霉孢子刺激A549細(xì)胞后NOD2蛋白的表達(dá)。(5)采用免疫沉降后westernblot的方法檢

13、測(cè)不同刺激強(qiáng)度的煙曲霉孢子刺激A549、THPl細(xì)胞后NOD2蛋白的表達(dá)。(6)ELISA法檢測(cè)煙曲霉孢子單獨(dú)和聯(lián)合NOD2的特異性配體MDP刺激A549、THPl細(xì)胞后TNF-α的分泌。結(jié)果：(1)煙曲霉孢子與A549、THPl孵育10h后胞漿內(nèi)即可見到吞噬的孢子，24h時(shí)溶酶體內(nèi)可見到部分消化狀態(tài)的煙曲霉孢子。(2)A549、THPl細(xì)胞在煙曲霉孢子刺激后24hNOD2、RIP2、TNF-QmRNA表達(dá)明顯上調(diào)，與0h比較差異有統(tǒng)計(jì)

14、學(xué)意義(P<0．05)。48hNOD2、RIP2、TNF-QmRNA表達(dá)均減少。(3)煙曲霉孢子刺激A549、THPl細(xì)胞后NOD2mRNA表達(dá)水平隨刺激強(qiáng)度的增加而上調(diào)，各組間表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。(4)免疫熒光法可見煙曲霉孢子刺激后NOD2蛋白表達(dá)增加。(5)煙曲霉孢子刺激A549、THPl細(xì)胞后NOD2蛋白的表達(dá)增加，不同刺激強(qiáng)度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

15、單獨(dú)刺激、煙曲霉孢子聯(lián)合MDP刺激組4組A549細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-a含量分別為10．46±0．70、¨．36±1．20、12．63±2．76、13．94±3．42pg／ml；4組THPl細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-a含量分別為27．40±5．72、27．93±9．¨、32．63±4．71、82．13±10．76pg／ml。MDP能夠顯著增加煙曲霉孢子刺激后細(xì)胞TNF-a的分泌(P