絲切蛋白(cofilin)在煙曲霉內(nèi)化侵入肺泡上皮細(xì)胞過(guò)程中的功能研究.pdf

1、背景和目的：侵襲性肺曲霉病是免疫受損宿主最常見(jiàn)的深部真菌感染，其發(fā)病率、死亡率居高不下，已對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害，因此對(duì)其致病機(jī)制的探討具有重要意義。其主要病原菌煙曲霉孢子在被吸入肺泡后可誘發(fā)肺泡上皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重排而內(nèi)化侵入上皮細(xì)胞，這是其逃避宿主巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞攻擊，造成后續(xù)侵襲性肺曲霉病發(fā)生發(fā)展的必要步驟。絲切蛋白(cofilin)是一類(lèi)肌動(dòng)蛋白骨架解聚因子，其活性變化在一系列以細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重排為基礎(chǔ)的重

2、要生命活動(dòng)中發(fā)揮調(diào)控作用。研究顯示cofilin在調(diào)節(jié)多種病原微生物侵染宿主細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，如HIV病毒侵染CD4+T細(xì)胞，已成為抗感染藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)之一。本研究旨在研究cofilin在煙曲霉內(nèi)化侵入肺泡上皮細(xì)胞過(guò)程中的作用及所涉及的信號(hào)通路。
　　方法：1）應(yīng)用免疫熒光法觀察煙曲霉內(nèi)化侵入肺泡上皮細(xì)胞過(guò)程中肌動(dòng)蛋白骨架重排的情況及p-cofilin分布情況。2）應(yīng)用western blot法檢測(cè)煙曲霉孢子刺激A54

3、9細(xì)胞后cofilin/p-cofilin蛋白水平表達(dá)。3）應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)煙曲霉膨脹孢子刺激A549細(xì)胞后cofilin轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。4）應(yīng)用制霉菌素保護(hù)法測(cè)定煙曲霉膨脹孢子對(duì)不同預(yù)處理的A549的內(nèi)化侵入率。
　　結(jié)果：1）煙曲霉膨脹孢子內(nèi)化侵入肺泡上皮細(xì)胞伴有肌動(dòng)蛋白骨架重排，侵入的孢子位于重排的骨架形成的吞噬小體內(nèi)。煙曲霉休眠孢子刺激A549細(xì)胞早期對(duì)細(xì)胞cofilin/p-cofilin蛋白水平表達(dá)無(wú)影響，一旦孢子膨

4、脹則可引起細(xì)胞早期p-cofilin蛋白水平表達(dá)動(dòng)態(tài)變化，呈先升后降，但對(duì)總cofilin蛋白水平及轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)無(wú)影響，且增加的p-cofilin定位于肌動(dòng)蛋白骨架重排形成的吞噬小體上。2）A549細(xì)胞cofilin表達(dá)下調(diào)、上調(diào)或不能磷酸化均可減弱煙曲霉膨脹孢子的內(nèi)化侵入。A549細(xì)胞應(yīng)用LIM激酶抑制劑或過(guò)表達(dá)slingshot磷酸酶破壞cofilin/p-cofilin狀態(tài)也減弱煙曲霉膨脹孢子的內(nèi)化侵入。3）A549細(xì)胞RhoA活

5、性降低或ROCK活性降低均可通過(guò)減少細(xì)胞p-cofilin表達(dá)而減弱煙曲霉膨脹孢子的內(nèi)化侵入。可溶性β-1，3-葡聚糖模擬煙曲霉膨脹孢子的刺激不能誘發(fā)A549細(xì)胞早期cofilin/p-cofilin動(dòng)態(tài)變化，且應(yīng)用dectin-1特異性抗體封閉細(xì)胞表面相應(yīng)受體也不能影響煙曲霉膨脹孢子引起的細(xì)胞早期p-cofilin蛋白水平表達(dá)變化。
　　結(jié)論：煙曲霉膨脹孢子感染肺泡上皮細(xì)胞可引起細(xì)胞早期cofilin/p-cofilin動(dòng)態(tài)變化