異種器官移植用血管內(nèi)皮細(xì)胞組織特異性表達(dá)人DAF、CD59轉(zhuǎn)基因小鼠的研究.pdf

1、第一部分血管內(nèi)皮細(xì)胞組織特異性表達(dá)人DAF、CD59轉(zhuǎn)基因小鼠的制備目的制備原代血管內(nèi)皮細(xì)胞組織特異性表達(dá)人DAF、CD59轉(zhuǎn)基因小鼠.方法用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ/BamHⅠ/ScaⅠ酶切該室構(gòu)建含有人DAFcDNA外源基因的質(zhì)粒,回收純化3.7kb DNA片段,依次包括人ICAM-2啟動(dòng)子序列,人DAF cDNA(含人DAF基因第一個(gè)內(nèi)含子)及SV40 splice/polyA終止信號(hào).結(jié)果4~6周齡80只雌鼠經(jīng)超排卵后分別與正常雄鼠

2、交配,共得到受精卵2100余枚,選取原核清晰的受精卵1700枚用于顯微注射,1300枚受精卵注射后仍健康,注射后存活受精卵的比率為76.5％(1300/1700),將它們分別移植入50只假孕母鼠的輸卵管中,其中30只受孕,足月后共產(chǎn)生原代鼠135只,移植受精卵的發(fā)育率為10.3％(135/1300).結(jié)論通過(guò)顯微注射方法,成功制備了轉(zhuǎn)基因原代鼠.第二部分血管內(nèi)皮細(xì)胞組織特異性表達(dá)人DAF、CD59轉(zhuǎn)基因小鼠的篩選目的從原代鼠中篩選出血管

3、內(nèi)皮細(xì)胞組織特異性表達(dá)人DAF、CD59轉(zhuǎn)基因小鼠.方法提取原代小鼠基因組DNA,以人ICAM-2啟動(dòng)子序列為模板,用PCR方法進(jìn)行外源基因整合初步篩選,并進(jìn)一步對(duì)PCR檢測(cè)中出現(xiàn)特異條帶小鼠基因組DNA行Southern印跡雜交分析.結(jié)論該實(shí)驗(yàn)成功地建立了血管內(nèi)皮細(xì)胞組織特異性表達(dá)人CD59、DAF轉(zhuǎn)基因小鼠(包括2只血管內(nèi)皮細(xì)胞組織特異性表達(dá)人CD59/DAF聯(lián)合轉(zhuǎn)基因小鼠).第三部分、血管內(nèi)皮細(xì)胞組織特異性表達(dá)人DAF,CD59轉(zhuǎn)

4、基因小鼠的傳代和表達(dá)檢測(cè)目的獲得子一代(F1代)轉(zhuǎn)基因鼠并探討外源基因在轉(zhuǎn)基因鼠傳代中的遺傳規(guī)律.方法將2只雌性雙基因轉(zhuǎn)基因小鼠與處在生育力旺盛期健康同種雄性小鼠進(jìn)行交配;從雄性人DAF基因、人CD59基因轉(zhuǎn)基因鼠中選取表達(dá)最好的分別與處在生育力旺盛期健康同種雌性小鼠進(jìn)行交配,F1代小鼠篩選方法同前.結(jié)論在轉(zhuǎn)基因小鼠與普通小鼠交配的傳代過(guò)程中,產(chǎn)生的F1代小鼠中有50％的陽(yáng)性整合鼠,表明穩(wěn)定整合的外源基因與宿主體內(nèi)的自身基因一樣也依據(jù)孟

5、德?tīng)栠z傳規(guī)律遺傳到F1代.但整合的外源基因在F1代小鼠中未完全實(shí)現(xiàn)表達(dá),提示有復(fù)雜的機(jī)制影響轉(zhuǎn)基因的表達(dá).第四部分、血管內(nèi)皮細(xì)胞組織特異性表達(dá)人DAF、CD59轉(zhuǎn)基因小鼠抗超急性排斥反應(yīng)的檢測(cè)目的檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠離體心臟抗排斥反應(yīng)能力.方法在改進(jìn)的Langendorff心臟灌流裝置上,用灌注液、20％稀釋人血清分別灌注轉(zhuǎn)人DAF轉(zhuǎn)基因鼠、轉(zhuǎn)人CD59基因轉(zhuǎn)基因鼠、普通小鼠,觀察不同時(shí)間各組心臟做功情況.采用免疫組織化學(xué)方法觀察人C3c、I

6、gM灌注后在心臟心肌組織沉積情況.結(jié)論普通小鼠心臟遭受較為強(qiáng)烈的超急排斥反應(yīng)損傷,而轉(zhuǎn)基因組心臟獲得了一定程度的抗超急排斥反應(yīng)能力.該實(shí)驗(yàn)建立的血管內(nèi)皮細(xì)胞組織特異性表達(dá)人CD59、DAF轉(zhuǎn)基因小鼠有一定的抗超急排斥反應(yīng)能力.該實(shí)驗(yàn)通過(guò)導(dǎo)入含有血管內(nèi)皮細(xì)胞組織特異性調(diào)控元件、目的基因自身第一個(gè)內(nèi)含子及人DAF、CD59cDNA序列的外源基因,在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)獲得了外源基因血管內(nèi)皮細(xì)胞組織特異性較為高效的表達(dá),并且證實(shí)了血管內(nèi)皮細(xì)胞組織特