血管內(nèi)皮細胞特異性miR-21敲除對小鼠主動脈重建的影響及其機制初探.pdf

1、血管重建（remodeling）指機體在生長及發(fā)育、衰老和疾病過程中，血管為適應(yīng)體內(nèi)外環(huán)境變化而發(fā)生的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能改變。血管形態(tài)結(jié)構(gòu)重建描述了血管的結(jié)構(gòu)變化，而功能重建則描述了血管舒張功能和血管力學(xué)性質(zhì)等變化。血管重建是心血管疾病的基本和共同的病理學(xué)基礎(chǔ)，其機制探討對于心血管疾病的防治具有重要意義。由于血管重建的體內(nèi)外影響因素眾多，以至于其機制迄今尚未完全闡明。近年來，microRNAs（miRs）在血管重建中的調(diào)控作用越來越受到人們

2、的關(guān)注,其中miR-21在心血管生物學(xué)及疾病方面的研究成為熱點。血管內(nèi)皮細胞（endothelial cells，ECs）miR-21功能的離體研究已有許多報道。然而，在體ECs的miR-21對心血管的作用尚缺少研究。本研究擬構(gòu)建ECs的miR-21特異敲除小鼠模型，探討在體情況下ECs的miR-21在血管重建中的作用及其機制，旨在為血管重建機制以及臨床相關(guān)疾病研究提供一些理論和實驗依據(jù)。
　　本文采用Cre/LoxP和FLP/F

3、RT系統(tǒng)構(gòu)建ECs的miR-21特異敲除小鼠模型，并用原位雜交（in situ hybridization,ISH）、PCR、熒光定量PCR和半定量RT-PCR的方法在DNA和RNA水平上明確是否敲除了ECs的miR-21。然后，應(yīng)用組織學(xué)染色方法分析血管壁幾何形態(tài)學(xué)和組織結(jié)構(gòu)成分；熒光定量PCR、Western blot法、Fastin法和Sircol法檢測血管彈性蛋白和膠原蛋白的表達變化，確定血管形態(tài)結(jié)構(gòu)重建。測量小鼠尾動脈血壓、動

4、脈張開角、順應(yīng)性、血管條最大張力和內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，確定血管功能重建。最后，用Western blot法檢測miR-21的靶蛋白—Smads家族蛋白和PTEN等的表達，初步探討了ECs的miR-21影響血管重建的機制。
　　結(jié)果顯示，①ISH、熒光定量PCR和半定量RT-PCR方法確定小鼠胸主動脈ECs的miR-21在RNA水平基本被刪除，PCR方法確定ECs的miR-21在DNA水平基本被刪除，但是主動脈組織還存在miR-21

5、；②ECs的miR-21特異敲除小鼠胸主動脈中膜明顯增厚、內(nèi)徑顯著變小，而壁厚/內(nèi)徑比顯著增加；彈性纖維面積比顯著下降，而膠原纖維面積比無顯著性差異；③ECs的miR-21特異敲除小鼠胸主動脈表達的彈性蛋白、I型膠原和III型膠原在mRNA和蛋白水平表達均顯著下降；Fastin法和Sircol法檢測結(jié)果也顯示，胸主動脈彈性蛋白和膠原蛋白含量減少；④ECs的miR-21特異敲除小鼠的舒張壓顯著降低、胸主動脈的張開角增加以及順應(yīng)性曲線下移；

6、胸主動脈血管條去甲腎上腺素誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)所產(chǎn)生的最大張力顯著下降，ACh誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)能力降低；⑤ECs的miR-21特異敲除小鼠血管組織的Smad7表達上升，Smad2/5表達下降，CTGF表達上升，下游的MMP-2和MMP-10表達上升，而TIMP-4表達下降，PTEN表達無顯著性差異；⑥ECs的miR-21特異敲除小鼠胸主動脈培養(yǎng)ECs的Smad7表達上升，Smad2/5表達下降，CTGF表達下降，p-Smad5水平

7、升高，PTEN表達上升，p-PTEN水平降低。
　　結(jié)果表明，本研究成功構(gòu)建的ECs的miR-21特異敲除小鼠具有在體研究內(nèi)皮細胞miR-21生理功能的科學(xué)價值。ECs的miR-21敲除導(dǎo)致胸主動脈發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能重建，主要表現(xiàn)為動脈中膜增厚、壁厚/內(nèi)徑比增加、彈性蛋白、I型膠原蛋白和III型膠原蛋白表達下降；動脈舒張壓下降、張開角增加、順應(yīng)性下降、血管條最大張力顯著降低和內(nèi)皮依賴性舒張能力受損。TGF/Smad和MMP/TIM