人HT、DAF和CD59基因聯合轉基因小鼠的制備及其抗異種器官移植免疫排斥反應的研究.pdf

1、目前認為從多個環(huán)節(jié)干預異種移植排斥反應才有可能使動物器官應用于臨床。本實驗采用受精卵顯微注射技術將本室構建的人α1,2-巖藻糖苷轉移酶(HT)基因、人衰變加速因子(DAF)和人膜反應性溶解抑制物(CD59)基因構件導入到小鼠的受精卵的雄原核中，通過受精卵移植建立表達多基因的轉基因小鼠，觀察這些基因轉移小鼠抗異種移植超急性排斥反應(HAR)的效果，并對其抗急性血管排斥反應(AVR)的機制進行初步研究。 第一部分人衰變加速因子重組質

2、粒的構建 目的:構建含雜合增強子UI的人DAF重組基因，應用于轉基因動物克服異種器官移植排斥反應的研究。 方法:ClaI/EcoRI雙酶切質粒pSP73得到UI增強子插入片段(0.3Kb)，將其插入pBluescriptⅡSK+克隆載體的相應酶切位點之間；XbaI/BamHI雙酶切質粒pGEM-7zf-DAF，得到含人ICAM-2啟動子及DAFcDNA序列的插入片段(3.7Kb)，將其也插入到pBluescriptⅡSK

3、+克隆載體的相應酶切位點之間。隨后轉化細菌，陽性轉化菌落質粒抽提及酶切鑒定。設計引物行PCR特異擴增檢驗。 結果:特異性3組酶切重組載體均產生了符合要求的相應條帶；PCR擴增出特異的330bp及321bp的片斷，符合設計要求。 結論:含雜合增強子UI的人DAF重組基因構建成功。 第二部分人HT/CD59及DAF基因轉移與轉基因鼠的制備 目的:制備轉移人HT/CD59雙基因和人DAF單基因的首代轉基因小鼠。

4、 方法:限制性內切酶NotI/PvuI雙酶切人HT基因重組質粒得到2.85kb的轉基因構件；限制性內切酶XbaI/ClaI雙酶切人DAF基因重組質粒得到4.0kb的轉基因構件；限制性內切酶BalⅡ/SmaI雙酶切人CD59基因重組質粒得到2.5kb的轉基因構件。采用受精卵顯微注射技術將人HT與CD59轉基因構件同時導入小鼠受精卵雄原核，將人DAF轉基因構件單獨導入小鼠受精卵雄原核制備轉基因小鼠。 結果:將人HT/CD59

5、轉基因構件同時導入2104枚受精卵，出生首代小鼠132只；將人DAF轉基因構件導入1123枚受精卵，出生首代小鼠89只。 結論:成功制備了轉移人HT/CD59雙基因和人DAF單基因的首代轉基因小鼠。 第三部分轉基因鼠人HT/CD59及DAF基因的整合與表達 目的:篩選出表達人HT/CD59、DAF基因的轉基因小鼠。 方法:常規(guī)提取首代小鼠基因組DNA，設計特異引物用PCR方法對外源基因整合進行初步篩選。對

6、PCR反應出現特異條帶的小鼠基因組DNA進行Southern印跡雜交進一步證實外源基因的整合。抽取外源基因整合陽性小鼠外周血，用流式細胞計數(FCM)方法檢測外源基因的表達。提取外源基因表達陽性小鼠心臟、肝臟、腎臟和肺臟等主要器官的總RNA行RT-PCR反應，觀察外源基因在轉基因小鼠體內主要器官的表達情況。對人HT基因表達陽性的轉基因小鼠主要器官進行免疫組織化學染色，觀察其表達對α-Gal抗原表達的影響。 結果:經PCR篩選，出

7、現330bp、915bp、224bp特異條帶的小鼠分別有42只、32只、41只，其中8只同時出現了915bp和224bp的特異條帶。Southern印跡雜交結果證實染色體中整合人HT、DAF、CD59基因的小鼠分別有15只、20只、19只，其中5只同時整合人HT和CD59基因。FCM檢測發(fā)現外周血單核細胞(PBMCs)表達人H抗原、DAF、CD59的小鼠分別有10只、4只、8只，其中4只小鼠人H抗原和CD59同時表達。FCM檢測陽性的轉

8、人HT、DAF和CD59基因小鼠相應的心臟、肝臟、腎臟和肺臟mRNA均表達陽性，并且各個器官組織之間的表達水平差別無統計學意義(P＞0.05)。人HT基因表達陽性的轉基因小鼠體內心臟、腎臟、肝臟和肺臟等不同組織H抗原均表達陽性，同時相應組織的α-Gal抗原表達顯著下降。 結論:本實驗制備的首代小鼠中有人HT、CD59和DAF分別表達的轉基因小鼠以及人HT與CD59基因同時表達的轉基因小鼠，并且人HT基因表達的轉基因小鼠體內α-G

9、al抗原表達降低。 第四部分轉基因鼠的傳代及三基因共表達轉基因鼠的建立 目的:探討外源基因在轉基因小鼠中的遺傳與表達規(guī)律并獲得三基因共表達的轉基因小鼠。 方法:G0代人HT/CD59基因同時表達陽性的轉基因鼠與G0代人DAF基因表達陽性的轉基因鼠交配生產F1代，同樣方法生產F2代小鼠。外源基因的整合與表達檢測方法同前。 結果:出生F1代小鼠17只，人DAF、HT、CD59基因整合的小鼠分別為9只、9只、1

10、0只，表達的分別為8只、7只、8只；人HT/DAF、HT/CD59、HT/CD59/DAF基因共整合的分別為2只、3只、2只，其中共表達的分別為2只、2只、1只。出生F2代小鼠8只，人HT/DAF、HT/CD59、HT/CD59/DAF基因共整合的分別為3只、3只、0只，其中共表達的分別為2只、3只、0只。 結論:成功獲得三基因共表達的轉基因小鼠，外源基因在子代小鼠體內也可以表達，但表達水平不同。 第五部分轉基因鼠抗異種

11、器官移植排斥反應的研究 目的:觀察轉基因克服異種器官移植超急性排斥反應的能力，并初步探討其抑制急性血管排斥反應的機制。 方法:將轉基因小鼠分為五組，第一組：普通小鼠；第二組：轉人HT基因；第三組：轉人HT/CD59雙基因；第四組：轉人HT/DAF雙基因；第五組：轉人HT/CD59/DAF三基因。采用改進的Langendorff心臟灌流裝置用12％人AB血清灌注小鼠的離體心臟，觀察各組心臟的存活時間和不同時間的做功情況。采

12、用免疫組織化學觀察灌注心臟血管內皮細胞表面人IgM、IgG、C3c和C9的沉積、NF-κB的激活與ICAM-1和E-Selectin的表達。 結果:人AB血清灌注后，第一組小鼠心臟做功能力急劇下降，15min時僅為最大值20％，接近45min時心臟停止搏動。第二組小鼠心臟做功能力也下降，但在60min時心臟做功仍維持在最大值的27％以上，平均存活時間為118min，心臟做功能力與搏動時間均高于第一組，差異有統計學意義(P＜0.0

13、5)。第三組、第四組小鼠心臟做功能力與存活時間均顯著高于第一組和第二組，差異有統計學意義(P＜0.05)，但兩組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。第五組小鼠心臟做功能力與存活時間與第三組和第四組相似。觀察灌注心臟的血管內皮細胞發(fā)現：第一組小鼠可見IgM、IgG、C3c和C9大量沉積，未見NF-κB、E-Selectin和ICAM-1陽性染色；第二組小鼠可見IgG沉積，C3c和C9沉積減少，未見IgM沉積，NF-κB、E-Select

14、in和ICAM-1陽性染色；第三組小鼠可見IgG和C3c沉積，未見IgM和C9沉積，第四組小鼠可見IgG沉積，C3c和C9少量沉積，未見IgM沉積，第五組小鼠可見IgG沉積，未見IgM、C3c、C9沉積。第三組、第四組和第五組小鼠均未見NF-κB、E-Selectin和ICAM-1陽性染色。 結論:轉人HT基因獲得了一定程度的抗異種移植HAR的能力；聯合轉基因可以克服異種移植HAR，并且可能通過抑制NF-κB激活而具有部分抑制A