胚鼠真皮細(xì)胞輔助毛囊重建的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 隨著通信技術(shù)的發(fā)展，人與人之間的交往日趨頻繁。為了在學(xué)習(xí)和工作中獲得更多的機(jī)會(huì)，人們開(kāi)始花費(fèi)更多精力來(lái)塑造良好的外形。于是，致力于塑造人類(lèi)美好外形的各種學(xué)科應(yīng)運(yùn)而生。日常交往中，一個(gè)人的相貌往往是第一印象的主要組成部分。而頭發(fā)則是這一組成部分中的主要成分之一。許多應(yīng)用于毛發(fā)保健的產(chǎn)品被投放到市場(chǎng)，產(chǎn)生了龐大的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。
　　 毛囊被覆在哺乳動(dòng)物體表，是哺乳動(dòng)物皮膚的附屬器官之一。它由上皮成分和真皮成分構(gòu)

2、成，上皮成分包括外根鞘、內(nèi)根鞘、毛母質(zhì)及毛干，真皮成分包括毛乳頭及真皮鞘。上皮成分與真皮成分的相互作用貫穿于毛囊的發(fā)育及周期性生長(zhǎng)的全過(guò)程。一旦上皮成分和真皮成分的相互作用出現(xiàn)了異常，毛囊的形態(tài)就會(huì)發(fā)生改變，從而影響人的外觀。臨床上表現(xiàn)為各種形式的禿發(fā)。如某些化療藥物能夠促使毛發(fā)迅速由生長(zhǎng)期進(jìn)入退行期和靜止期，臨床上會(huì)表現(xiàn)為使用后毛發(fā)大量剝脫。內(nèi)分泌的激素如雄性激素能使毛囊出現(xiàn)微型化，并使毛發(fā)周期停滯在靜止期，臨床上表現(xiàn)為逐漸加重的禿發(fā)

3、。
　　 各種原因引起的禿發(fā)給人們的社會(huì)生活帶來(lái)了諸多不便。目前臨床上治療禿發(fā)的方法主要有藥物療法和手術(shù)療法。用于治療禿發(fā)的藥物主要有非那雄胺以及米諾地爾等。非那雄胺通過(guò)抑制睪酮轉(zhuǎn)化為雙氫睪酮從而抑制毛囊微型化，毛發(fā)得以重新增粗變長(zhǎng)，禿發(fā)的癥狀得以緩解。米諾地爾治療禿發(fā)的機(jī)制則是通過(guò)促進(jìn)毛囊中的毛乳頭細(xì)胞分泌VEGF，加強(qiáng)其毛發(fā)誘導(dǎo)能力，從而促進(jìn)毛囊的生長(zhǎng)。然而，盡管藥物治療能夠在一定時(shí)期內(nèi)緩解禿發(fā)癥狀，但是一旦停止用藥，禿發(fā)的

4、現(xiàn)象又會(huì)復(fù)發(fā)。除此之外，長(zhǎng)期使用藥物治療禿發(fā)會(huì)發(fā)生較明顯的副作用。另外，并非所有人使用治療禿發(fā)的藥物都一樣有效。為了解決這些問(wèn)題，手術(shù)療法正越來(lái)越廣泛地被人們采用。
　　 人的肉眼可以分辨的毛發(fā)濃密程度上限約為每平方厘米面積內(nèi)30根毛發(fā)，小于正常人的平均毛發(fā)濃密程度。也就是說(shuō)理論上可以通過(guò)毛發(fā)的合理分布來(lái)掩蓋原來(lái)禿發(fā)的區(qū)域，同時(shí)又不至于使供區(qū)毛發(fā)看起來(lái)比手術(shù)前稀疏。上世紀(jì)60年代以前由于技術(shù)的限制，人們只能通過(guò)擴(kuò)張頭皮組織行皮瓣

5、轉(zhuǎn)移的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)毛發(fā)的重新分布，這不僅在外形上難以準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)禿發(fā)區(qū)的縮減，而且創(chuàng)傷較大。而到了上世紀(jì)60年代以后，隨著顯微外科技術(shù)的發(fā)展以及毛囊單位概念的提出，毛發(fā)的重新分布得以用毛囊單位顯微移植的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)在供區(qū)切取頭皮條進(jìn)行分離或直接用鉆頭在供區(qū)鉆取毛囊單位的方法，得到大量可供移植的毛囊單位，然后按照受區(qū)的性狀選取相應(yīng)的毛囊單位進(jìn)行移植，可以使禿發(fā)區(qū)定量地得到類(lèi)型適宜的毛囊單位。在供區(qū)選擇方而，供區(qū)優(yōu)勢(shì)理論認(rèn)為移植到受區(qū)的毛發(fā)

6、將保持其在原有供區(qū)時(shí)的性狀。這就使得毛發(fā)濃密的枕部成為了良好的毛發(fā)供區(qū)。因?yàn)檎聿康拿l(fā)較少受到毛囊微型化的影響，因此在枕部取得的毛囊單位在被移植到禿發(fā)區(qū)之后亦不會(huì)發(fā)生微型化。此外，在枕部用切取或鉆取得到毛囊單位的方法所留下的瘢痕均因?yàn)橹車(chē)l(fā)的掩蓋而不明顯。然而其應(yīng)用也因?yàn)椴糠只颊叩墓﹨^(qū)不足而受到了限制。毛囊單位移植術(shù)畢竟不能增加毛囊的數(shù)量，而只是改變了毛囊的分布而已。為了實(shí)現(xiàn)毛囊數(shù)量的增加，毛囊組織工程開(kāi)始迅速發(fā)展。
　　 毛

7、囊組織工程致力于毛囊的重建。毛囊發(fā)育所需的天然微環(huán)境成分復(fù)雜，目前還難以在體外完全地進(jìn)行模擬。因此目前尚無(wú)法在體外實(shí)驗(yàn)中重建出結(jié)構(gòu)成熟的毛囊。對(duì)于毛囊的體內(nèi)重建，目前已經(jīng)取得了大量的成果。許多動(dòng)物模型被成功地構(gòu)建出來(lái)。常用的動(dòng)物模型有小室模型、注射模型、皮瓣模型以及三明治模型。各種動(dòng)物模型有著不同的優(yōu)缺點(diǎn)。其中小室模型所重建出的毛發(fā)的方向較為一致，可以于動(dòng)物體表直接觀察到重建出來(lái)的毛發(fā)纖維。通過(guò)按不同的需要使用不同的動(dòng)物模型，人們開(kāi)始對(duì)

8、各種細(xì)胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力的變化條件進(jìn)行探索，以求找到能夠大量增殖并維持較強(qiáng)的毛發(fā)誘導(dǎo)能力的細(xì)胞，為將來(lái)在體外實(shí)驗(yàn)中重建出結(jié)構(gòu)完整、功能正常的毛囊創(chuàng)造條件。實(shí)驗(yàn)中人們發(fā)現(xiàn)那些原本具有毛發(fā)誘導(dǎo)能力的細(xì)胞在經(jīng)歷了增殖傳代之后其子代細(xì)胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力明顯減弱。而通過(guò)將某些生物活性物質(zhì)作用于毛發(fā)誘導(dǎo)能力較弱的細(xì)胞，可以加強(qiáng)這些細(xì)胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力。較為常見(jiàn)的一類(lèi)是作用于毛囊真皮成分中的毛乳頭細(xì)胞，使體外培養(yǎng)后的毛乳頭細(xì)胞聚集形成毛乳頭的能力得到加強(qiáng)。

9、真皮細(xì)胞的聚集是毛囊發(fā)育的基礎(chǔ)。啟動(dòng)毛囊發(fā)育的信號(hào)稱(chēng)為第一真皮信號(hào)。這種信號(hào)廣泛存在于胚胎真皮細(xì)胞中，胚胎真皮細(xì)胞分泌該信號(hào)，而其中一部分胚胎真皮細(xì)胞同時(shí)還是該信號(hào)的靶細(xì)胞，它們接受第一真皮信號(hào)的刺激而發(fā)生聚集形成真皮聚集體，開(kāi)始了毛囊的發(fā)育過(guò)程。為了探索這種胚胎期的真皮信號(hào)對(duì)成體細(xì)胞的作用，我們開(kāi)始了實(shí)驗(yàn)。因?yàn)榈谝徽嫫ば盘?hào)廣泛分布于胚胎期小鼠的真皮且于胚胎期第14天達(dá)到分泌高峰，所以本實(shí)驗(yàn)選取胎齡14天的胚鼠真皮細(xì)胞作為信號(hào)源，觀察其

10、對(duì)成體小鼠真皮細(xì)胞毛發(fā)誘導(dǎo)能力的影響。通過(guò)統(tǒng)計(jì)重建出的毛發(fā)數(shù)目來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力。為便于毛發(fā)數(shù)目的統(tǒng)計(jì)，本實(shí)驗(yàn)選取經(jīng)典的小室模型來(lái)重建毛發(fā)，因?yàn)樾∈夷Ｐ椭亟ǔ龅拿l(fā)生長(zhǎng)于體表且方向一致，便于收集和計(jì)數(shù)。本實(shí)驗(yàn)共分為兩部分進(jìn)行。
　　 一、小室模型的制作及細(xì)胞毛發(fā)誘導(dǎo)能力的檢測(cè)
　　 目的:觀察構(gòu)建的小室模型是否便于毛發(fā)收集及毛發(fā)計(jì)數(shù)，是否能有效反映細(xì)胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力強(qiáng)弱。同時(shí)觀察不同細(xì)胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力強(qiáng)弱。為后續(xù)實(shí)

11、驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　 方法:1、取醫(yī)用聚丙烯材料制成的試劑瓶?jī)?nèi)塞，用針頭在其底部中央打孔制成小室。2、處死出生1天內(nèi)的C57BL/6近交系小鼠，取其背部皮膚分別制備新鮮分離的新生鼠真皮細(xì)胞懸液及新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞懸液，并用DiI細(xì)胞膜紅色熒光探針標(biāo)記新鮮分離的新生鼠真皮細(xì)胞懸液。3、另取新生鼠真皮細(xì)胞經(jīng)原代培養(yǎng)后制成細(xì)胞懸液，并進(jìn)行DiI細(xì)胞膜紅色熒光探針標(biāo)記。4、取胎齡14天的胚鼠皮膚制備胚鼠真皮細(xì)胞懸液，并進(jìn)行DiI細(xì)胞膜

12、紅色熒光探針標(biāo)記。5、呈圓形剪去一塊裸鼠背部皮膚，置入小室，將各種細(xì)胞按照分組方式經(jīng)由小室上的小孔注入小室。6、分別建立新鮮分離的新生鼠真皮細(xì)胞(1×107)+新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞(1×107)組;培養(yǎng)的新生鼠真皮細(xì)胞(1×107)+新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞(1×107)組;胚鼠真皮細(xì)胞(1×107)+新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞(1×107)組;新鮮分離的新生鼠真皮細(xì)胞(1×107)組;新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞(1×107)組;胚鼠真

13、皮細(xì)胞(1×107)組。對(duì)各組的毛發(fā)重建情況進(jìn)行觀察。
　　 結(jié)果:新鮮分離的新生鼠真皮細(xì)胞(1×107)+新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞(1×107)組有大量毛發(fā)形成;培養(yǎng)的新生鼠真皮細(xì)胞(1×107)+新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞(1×107)組有少量毛發(fā)形成;胚鼠真皮細(xì)胞(1×107)+新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞(1×107)組無(wú)毛發(fā)形成;新鮮分離的新生鼠真皮細(xì)胞(1×107)組無(wú)毛發(fā)形成;新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞(1×107)組無(wú)毛

14、發(fā)形成;胚鼠真皮細(xì)胞(1×107)組無(wú)毛發(fā)形成。新鮮分離的新生鼠真皮細(xì)胞(1×107)+新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞(1×107)組的毛發(fā)數(shù)量與培養(yǎng)的新生鼠真皮細(xì)胞(1×107)+新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞(1×107)組的毛發(fā)數(shù)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3，t=14.85，p＜0.05)。取有毛發(fā)形成的組織進(jìn)行切片于熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)所有毛囊的毛乳頭均為DiI熒光陽(yáng)性。所形成的毛發(fā)排列整齊。在大體觀、組織學(xué)觀察及掃描電子顯微鏡下均與正常C

15、57BL/6近交系小鼠的背部毛發(fā)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異，能進(jìn)行正常的毛發(fā)周期循環(huán)。
　　 結(jié)論:1、以試劑瓶?jī)?nèi)塞構(gòu)建而成的小室能夠有效地重建出排列整齊的毛發(fā)，便于毛發(fā)的收集和計(jì)數(shù)，可以被用于比較細(xì)胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力。2、毛囊的重建依賴(lài)于上皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞的相互作用，二者缺一不可。3、新鮮分離的新生鼠真皮細(xì)胞在經(jīng)歷了體外培養(yǎng)后毛發(fā)誘導(dǎo)能力減弱。4、胎齡14天的胚鼠真皮細(xì)胞無(wú)法和新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞相互作用形成毛囊。
　　 二、胚

16、鼠真皮細(xì)胞輔助體外培養(yǎng)的新生鼠真皮細(xì)胞行毛囊重建的效果觀察
　　 目的:觀察胚鼠真皮細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)后的新生鼠真皮細(xì)胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力的影響，并探討其作用機(jī)制。
　　 方法:取以體外培養(yǎng)后的新生鼠真皮細(xì)胞(1×107)與新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞(1×107)構(gòu)建毛囊重建體系。在該體系中加入以DiI細(xì)胞膜紅色熒光探針標(biāo)記的胎齡14天的胚鼠真皮細(xì)胞(1×106)作為實(shí)驗(yàn)組，不加胎齡14天的胚鼠真皮細(xì)胞作為對(duì)照組。將實(shí)驗(yàn)組形成的毛

17、發(fā)數(shù)量與對(duì)照組作比較。并取實(shí)驗(yàn)組形成的毛發(fā)進(jìn)行組織學(xué)觀察。
　　 結(jié)果:1.培養(yǎng)的新生鼠真皮細(xì)胞(1×107)+新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞(1×107)+胚鼠真皮細(xì)胞(1×106)組亦即實(shí)驗(yàn)組有大量毛發(fā)形成，培養(yǎng)的新生鼠真皮細(xì)胞(1×107)+新鮮分離的新生鼠表皮細(xì)胞(1×107)組亦即對(duì)照組僅有少量毛發(fā)形成，二者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3，t=6.75，p＜0.05)。2.實(shí)驗(yàn)組的DiI熒光均位于毛囊間真皮。未發(fā)現(xiàn)DiI熒光陽(yáng)性