腎虛證代謝組學(xué)及六味地黃湯的干預(yù)研究.pdf

1、代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為中國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)的現(xiàn)代化研究提供了一種選擇，將代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用到中醫(yī)證候診斷和復(fù)方中藥藥效評(píng)價(jià)方面具有廣闊的前景。本課題將代謝組學(xué)的方法應(yīng)用于中醫(yī)藥的研究，以中醫(yī)中常見的腎虛證作為研究對(duì)象，通過高劑量氫化可的松誘導(dǎo)的大鼠建立模型，選擇六味地黃方作為干預(yù)的復(fù)方中藥，分別應(yīng)用NMR，LC-MSn，LC-TOF/MS，GC-MS對(duì)大鼠尿液和血漿樣品進(jìn)行分析，結(jié)合模式識(shí)別方法進(jìn)行分類和尋找標(biāo)記物，并解釋代謝物的可能代謝途徑。

2、 首先，選擇NMR分析技術(shù)結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析的代謝組學(xué)方法研究腎虛癥大鼠、正常大鼠和復(fù)方中藥六味地黃湯(LWDHT)干預(yù)的腎虛模型大鼠(LWDHT大鼠)尿液成分譜的變化。使用氫化可的松誘導(dǎo)wistar大鼠建立腎虛模型，NMR分析對(duì)照組、模型組和LWDHT組大鼠的尿液，使用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)處理圖譜數(shù)據(jù)，尋找標(biāo)記物，并解釋代謝產(chǎn)物的變化，相關(guān)代謝通路或代謝網(wǎng)絡(luò)的變化。對(duì)模型組和空白組，LWDHT

3、組三個(gè)組別進(jìn)行模式識(shí)別，結(jié)果顯示三組之間可以實(shí)現(xiàn)分類，模型組大鼠與對(duì)照組比較，顯示腎虛證大鼠機(jī)體在高劑量的氫化可的松誘導(dǎo)下，迅速進(jìn)入了一個(gè)“機(jī)能亢進(jìn)”的狀態(tài)，這種對(duì)于能量和免疫系統(tǒng)的“過消耗”最后導(dǎo)致大鼠進(jìn)入“耗竭”狀態(tài)，在這個(gè)過程中，相關(guān)代謝通路發(fā)生了顯著變化，肌氨酸酐(creatinine，δ4.05，3.04)等的共振峰相對(duì)積分面積增高，而二甲胺(dimethylamine，δ2.718)，天冬氨酸(asparaginic aci

4、d，δ2.831)牛黃酸(taurine，δ3.44，3.28)，馬尿酸(hippurate，δ7.84，7.56，3.97)等的相對(duì)積分面積則明顯下降，這預(yù)示著糖皮質(zhì)激素可能引起了腎上腺皮質(zhì)分泌功能的損害。模型大鼠尿液的肌氨酸酐含量的增加，提示著腎虛與腎功能異常是密切相關(guān)的。琥珀酸(succinate，δ2.41)是三羧酸循環(huán)能量代謝及糖酵解的中間產(chǎn)物，其含量的降低，通常是由于線粒體功能紊亂引起。實(shí)驗(yàn)中LWDHT組的聚類點(diǎn)群位置處于模

5、型組和空白組之間，顯示LWDHT出對(duì)腎虛證大鼠具有修復(fù)代謝的作用。 同時(shí)也應(yīng)用NMR方法分析了三個(gè)組別大鼠的血漿，結(jié)合主成分分析和偏最小二乘判別分析，三個(gè)組別可以聚類分類，對(duì)于引起三個(gè)不同的代謝模式下大鼠血漿分類的標(biāo)記成分進(jìn)行鑒別，并對(duì)其代謝作出可能的解釋。結(jié)果顯示可以發(fā)現(xiàn)模型組的大鼠的血漿中的酪氨酸(tyrosine，δ3.18，6.88)含量有所增加，這可能是由于氫化可的松誘導(dǎo)加速了兒茶酚胺類物質(zhì)的生物合成。模型組大鼠血漿中

6、的葡萄糖和乳糖水平有所上升，結(jié)合生糖氨基酸丙氨酸濃度的升高，表明氫化可的松干預(yù)后大鼠代謝發(fā)生變化，糖酵解，糖異生的過程加強(qiáng)。檸檬酸(citric acid，δ2.53，2.72)，琥珀酸(succinate，δ2.41)是三羧酸循環(huán)能量代謝及糖酵解的中間產(chǎn)物，其含量的降低，通常是由于線粒體功能紊亂引起。 其次應(yīng)用LC-MSn分析技術(shù)結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析的代謝組學(xué)方法研究腎虛癥大鼠、正常大鼠、LWDHT大鼠尿液的組成成分譜的變化。L

7、C-MSn分析三個(gè)組別的尿液，使用化學(xué)計(jì)量學(xué)處理圖譜數(shù)據(jù)。分別使用主成分分析(PCA)，自組織映射網(wǎng)絡(luò)(SOM)，模糊聚類(Fussy classify)三種模式識(shí)別方法，三個(gè)組別可以實(shí)現(xiàn)分類。顯示了不同的模式識(shí)別技術(shù)對(duì)于代謝組學(xué)的后期數(shù)據(jù)處理各自具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。 再次應(yīng)用基于LC-TOF/MS分析技術(shù)結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析的代謝組學(xué)方法研究腎虛癥大鼠、正常大鼠、LWDHT干預(yù)大鼠尿液成分譜的變化，LC-TOF/MS分析對(duì)照組，模型

8、組和LWDHT干預(yù)組大鼠的尿液，結(jié)合PCA和PLS-DA模式識(shí)別，尋找標(biāo)記物，并解釋標(biāo)記物歸屬及代謝通路或代謝網(wǎng)絡(luò)的變化。結(jié)果顯示，三個(gè)組別可以實(shí)現(xiàn)分類，尋找到4個(gè)可能的代謝產(chǎn)物，分別為色氨酸，馬尿酸，芥子醇，N1-Methyl-2-pyridone-5-carboxamide，其中色氨酸，馬尿酸的量增加，可以推測(cè)是兒茶酚胺的代謝途徑發(fā)生上調(diào)，馬尿酸的增加說明苯丙氨酸的代謝發(fā)生異常。 同時(shí)應(yīng)用LC-TOF/MS分析技術(shù)分析了三組

9、大鼠的血漿，尋找到兩個(gè)脂類的標(biāo)記物，且兩者都呈現(xiàn)量的增加，顯示在氫化可的松干預(yù)后，大鼠的脂類合成加快，在血漿中蓄積了更多的脂類，這與氫化可的松可以促進(jìn)脂類的合成報(bào)道是一致的。 最后應(yīng)用GC-MS分析技術(shù)結(jié)合PCA和PLS-DA的代謝組學(xué)方法研究腎虛癥大鼠、正常大鼠、LWDHT干預(yù)大鼠尿液的成分譜的變化。GC-MS分析對(duì)照組，模型組，LWDHT干預(yù)組大鼠的尿液，使用PCA和PLS-DA模式識(shí)別，三組之間可以實(shí)現(xiàn)分類，并且模型組大鼠

10、在高劑量的氫化可的松誘導(dǎo)后代謝模式迅速發(fā)生變化，有正常代謝模式進(jìn)入了一個(gè)“機(jī)能亢進(jìn)”的狀態(tài)，至造模結(jié)束，這種對(duì)于能量和免疫系統(tǒng)的“過消耗”最后導(dǎo)致了大鼠進(jìn)入“耗竭”狀態(tài)，在這個(gè)過程中相關(guān)代謝通路發(fā)生顯著變化，由于氫化可的松的干預(yù)，酪氨酸的含量增加，顯示可能是兒茶酚胺的生化合成途徑發(fā)生蓄積，一些游離脂肪酸的含量增加，這與糖皮質(zhì)激素促進(jìn)脂類的合成是一致的。尿核苷代謝的水平的提高，推測(cè)是由于uridine diphosphate-GT的活性增

11、加引起的，這是由于氫化可的松誘導(dǎo)的肝臟GT表達(dá)的結(jié)果。 總之通過不同的分析技術(shù)分析空白大鼠、腎虛證大鼠和LWDHT干預(yù)的大鼠的尿樣和血漿的分析結(jié)果顯示，對(duì)于復(fù)雜的生物體液，單一的分析技術(shù)只能給出部分的化學(xué)和生物信息，將多種分析技術(shù)結(jié)合進(jìn)行生物體液的研究是必需的和可行的。腎虛證作為常見的中醫(yī)證之一，本課題應(yīng)用代謝組學(xué)的方法對(duì)其進(jìn)行了研究，為深入的認(rèn)識(shí)腎虛證及相關(guān)疾病提供幫助，LWDHT作為一個(gè)復(fù)雜的混合物系統(tǒng)，對(duì)腎虛大鼠代謝顯示出