IFN-γ延長(zhǎng)HBV持續(xù)時(shí)間及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究發(fā)現(xiàn),在高壓水注射HBV復(fù)制小鼠模型中,IFN-γ能夠延長(zhǎng)HBV持續(xù)時(shí)間,但其具體的作用機(jī)制尚不明確。因此,本研究從病毒學(xué)及免疫學(xué)角度來(lái)探討IFN-γ延長(zhǎng)HBV持續(xù)時(shí)間的機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用高壓水注射的方法將pAAV/HBV1.2和pCMV2/IFN-null或pAAV/HBV1.2和pCMV2/IFN-γ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到BALB/c小鼠肝細(xì)胞內(nèi),不同時(shí)間點(diǎn)采集小鼠血清和肝脾標(biāo)本,ELISA方法

2、檢測(cè)小鼠血清HBV抗原和抗體,免疫組化檢測(cè)肝內(nèi)HBcAg表達(dá)水平,Real-TimePCR檢測(cè)HBV復(fù)制水平及肝內(nèi)免疫相關(guān)分子的mRNA水平,ELISPOT檢測(cè)HBV特異性免疫應(yīng)答,FACS檢測(cè)肝脾內(nèi)淋巴細(xì)胞PD-1和FoxP3的表達(dá),H&E染色觀察肝臟炎性浸潤(rùn),IFCC法測(cè)血清ALT水平。觀察IFN-γ對(duì)HBV的作用并探討IFN-γ是否通過(guò)調(diào)節(jié)HBV特異性免疫應(yīng)答及免疫負(fù)調(diào)控來(lái)延長(zhǎng)HBV持續(xù)時(shí)間。
　　2.將質(zhì)粒pcDNA3.1

3、(+)/HBs采用肌肉注射聯(lián)合電擊免疫BALB/c小鼠,免疫后2周,高壓水注射pAAV/HBV1.2和pCMV2/IFN-γ質(zhì)粒,不同時(shí)間點(diǎn)采集小鼠血清,ELISA法檢測(cè)HBV抗原和抗體水平,觀察IFN-γ對(duì)HBV的作用。
　　3.高壓水注射方法將HBeAg/core-nullpAAV/HBV1.2和pCMV2/IFN-γ或pcDNA3.1(+)/HBs和pCMV2/IFN-γ分別轉(zhuǎn)染BALB/c小鼠,不同時(shí)間點(diǎn)采集小鼠血清,EL

4、ISA檢測(cè)血清HBV抗原和抗體水平,觀察IFN-γ對(duì)HBsAg持續(xù)時(shí)間的影響。
　　結(jié)果：
　　1.HBV平均持續(xù)時(shí)間為:pAAV/HBV1.2組為28天、pCMV2/IFN-null處理組為22.8天、pCMV2/IFN-γ處理組為44.6天。結(jié)果表明,IFN-γ顯著延長(zhǎng)HBV在BALB/c小鼠體內(nèi)持續(xù)時(shí)間(P=0.000)。
　　2.IFN-γ具有抗HBV作用,早期抑制HBV復(fù)制及表達(dá),晚期促進(jìn)HBV持續(xù)。

5、　　3.IFN-γ抑制HBsAb和HBcAb產(chǎn)生,抑制HBV體液免疫應(yīng)答。pAAV/HBV1.2注射后第10天,IFN-γ抑制HBcAg特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答;第20天,3組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;第30天,IFN-γ促進(jìn)HBcAg特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答持續(xù)。此外,在第10、20、30天,未檢測(cè)到HBsAg特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　4.IFN-γ在第注射后10、20、30天均未誘導(dǎo)肝脾淋巴細(xì)胞PD-1及FoxP3的表達(dá),但誘導(dǎo)肝內(nèi)PD-L

6、1、NOS2、IDO、SOCS等分子高表達(dá)。
　　5.在pAAV/HBV1.2小鼠模型中,注射低劑量pAAV/HBV1.2(2.5μg),IFN-γ延長(zhǎng)HBV持續(xù)時(shí)間(P=0.009);注射高劑量質(zhì)粒(50μg),IFN-γ延長(zhǎng)HBV持續(xù)時(shí)間(P=0.015)。
　　6.pcDNA3.1(+)/HBs基因免疫小鼠成功后,再注射pAAV/HBV1.2和pCMV2/IFN-γ,IFN-γ促進(jìn)HBsAb產(chǎn)生,促進(jìn)HBV清除。

7、>　　7.在HBeAg/core-nullpAAV/HBV1.2小鼠模型中,IFN-γ則促進(jìn)HBsAg的清除(P=0.036)。在pcDNA3.1(+)/HBs小鼠模型中,IFN-γ對(duì)HBsAg清除無(wú)影響。
　　結(jié)論：
　　1.在BALB/c小鼠模型中IFN-γ早期抑制HBV復(fù)制和表達(dá),同時(shí)抑制HBV體液免疫應(yīng)答,并且延長(zhǎng)HBV持續(xù)時(shí)間。
　　2.HBcAg引發(fā)的特異性免疫應(yīng)答與病毒清除無(wú)直接關(guān)系,IFN-γ也未通過(guò)誘

8、導(dǎo)免疫負(fù)調(diào)控來(lái)延長(zhǎng)病毒的持續(xù)。
　　3.IFN-γ延長(zhǎng)HBV持續(xù)時(shí)間與抑制HBcAg免疫應(yīng)答及HBsAb產(chǎn)生有關(guān)。
　　本研究的創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.在HBV復(fù)制小鼠模型中發(fā)現(xiàn)IFN-γ延長(zhǎng)HBV持續(xù)時(shí)間。
　　2.闡明IFN-γ延長(zhǎng)HBV持續(xù)時(shí)間與抑制HBcAg免疫應(yīng)答有關(guān)。
　　本研究的意義：
　　IFN-γ是一個(gè)多功能細(xì)胞因子,其作用效果和機(jī)制與病毒和宿主的多種因素有關(guān),本研究以高壓水注射HBV復(fù)制