骨髓間充質(zhì)干細胞預處理對LPS誘導大鼠DIC模型的器官保護作用.pdf

1、研究目的:研究骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)預處理對脂多糖(LPS)誘導彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)模型大鼠的器官保護性作用并探討其機制。
　　 研究方法:
　　 第一部分:取同種異體Wistar大鼠原代骨髓間充質(zhì)干細胞進行傳代培養(yǎng)。對培養(yǎng)出的骨髓干細胞進行形態(tài)觀察，考察其增殖能力;通過流式細胞儀對其細胞表型進行鑒定;在特定條件下培養(yǎng)BMSCs向內(nèi)皮細胞，成骨細胞，脂肪細胞的分化，以證實其潛在可塑性，進一步確定其為BMSC

2、s。
　　 第二部分:LPS誘導Wistar大鼠DIC模型的建立。30只成年雄性Wistar大鼠，月齡7周，體重160-170g，分為2組，實驗組和對照組各15只，按劑量30mg/kg腹腔內(nèi)注射異戊巴比妥鈉麻醉后，實驗組經(jīng)尾靜脈或股靜脈緩慢注射2mlLPS(3mg/kg，1小時)，而對照組給予等量生理鹽水。深麻醉下分別在LPS注射前及注射后4小時和8小時經(jīng)下腔靜脈抽取靜脈血，測定以下凝血參數(shù):血小板(PLT)數(shù)量，纖維蛋白原(F

3、ib)，部分凝血活酶時間(APTT)，凝血酶原時間(PT)，D-2聚體(D-D)。在LPS注射8小時后處死大鼠。取實驗組及對照組大鼠心臟，肝臟，腎臟，肺等主要器官的組織用10％甲醛固定24h，分別行HE染色和Mallory磷鎢酸蘇木精染色（PTAH染色），顯微鏡下觀察各臟器細胞形態(tài)，纖維血栓形成情況，并進行對比;同時計數(shù)100個腎小球，觀察其中有纖維蛋白微血栓的腎小球所占比例，以判斷本組實驗LPS能否成功誘導建立DIC模型。
　　

4、 第三部分:慢病毒介導GFP轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞及體內(nèi)檢測。慢病毒載體(PGCL-GFP、pHelper1.0、pHelper2.0)包裝后獲取病毒的上清液保存。取第3代生長狀態(tài)良好的大鼠BMSC5×104個，分別與0.25、2.5、5、12.5、25感染復數(shù)(MOI)的病毒液，在Polybrene液中(8g/ml)，32℃，1000g離心2小時，然后種于12孔板培養(yǎng)，每孔含10％FBS的DMEM1.5ml;12h后換液，此后每3天換

5、液1次并觀察BMSCs熒光表達情況;第5天每個孔取5個視野計算平均轉(zhuǎn)染率，了解MOI與轉(zhuǎn)染效率的關系，選擇最佳MOI。取月齡7周，體重160-170g成年雄性Wistar大鼠10只，經(jīng)大鼠尾靜脈或股靜脈注入1ml培養(yǎng)液（含有GFP標記轉(zhuǎn)染5天后BMSCs數(shù)量約1×106）共3次，每次間隔24h，第3次注射24h后處死大鼠，取大鼠心臟組織，用10％甲醛固定24h，然后行HE及抗GFP過氧化物酶染色。觀察心肌組織內(nèi)是否有BMSCs存活。

6、r>　　 第四部分:上述實驗成功后，取60只成年雄性Wistar大鼠，月齡7周，體重160-170g，按照BMSCs預處理和LPS注射方案不同分為6組，每組各有大鼠10只。處理組1:1ml培養(yǎng)液（不含BMSCs）注射3次，每次間隔24小時，進行預處理。在最后一次預處理結(jié)束后24h，注射1mlLPS(劑量，3mg/kg)。處理組2:1ml培養(yǎng)液（含BMSCs1×103）注射3次，每次間隔24小時，進行預處理。在最后一次預處理結(jié)束后24h

7、，注射1mlLPS(劑量，3mg/kg)。處理組3:1ml培養(yǎng)液（含BMSCs1×104）注射3次每次間隔24小時，進行預處理。在最后一次預處理結(jié)束后24h，注射1mlLPS(劑量，3mg/kg)。處理組4:1ml培養(yǎng)液(含BMSCs1×105)注射3次每次間隔24小時，進行預處理。在最后一次預處理結(jié)束后24h，注射1mlLPS(劑量，3mg/kg)。處理組5:1ml培養(yǎng)液（含BMSCs1×106）注射3次，每次間隔24小時，進行預處理

8、。在最后一次預處理結(jié)束后24h，注射1mlLPS(劑量，3mg/kg)。對照組:1ml培養(yǎng)液，不含BMSCs，注射3次，每次間隔24小時。在最后一次注射后24h，注射生理鹽水1ml（不含LPS）。共6組。分別在LPS（或不含LPS）注入前及注入后4小時和8小時各抽取靜脈血，測量以下參數(shù):PLT，F(xiàn)ib，D-2聚體(D-D)，APTT，PT，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，干擾素-γ(IFN-γ)，白細胞介素-1β(IL-1β)，肌酐(C

9、r)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)，內(nèi)皮素(ET)。取心臟，肝臟，腎臟及肺部組織進行HE染色及PTAH染色，檢測各器官組織細胞形態(tài)及微纖維血栓形成情況。為了進一步證明BMSCs預處理對LPS誘導DIC大鼠的保護作用，我們選擇另外60只成年雄性Wistar大鼠，月齡7周，體重160-170g，隨機分為三組，觀察短期內(nèi)大鼠死亡事件。為更好觀察短期內(nèi)大鼠死亡事件，我們加大LPS注射劑量至10mg/kg，觀察24小時

10、內(nèi)BMSCs預處理對LPS誘導DIC的保護作用。第1組:LPS注射，(LPS10mg/kg);第2組:BMSCs預處理，（1×103/次×3次，每次間隔24小時）+LPS注射（10mg/kg，在BMSCs最后一次預處理結(jié)束后24h進行）。第3組:BMSCs預處理，（1×105/次×3次，每次間隔24小時）+LPS注射（10mg/kg，在BMSCs最后一次預處理結(jié)束后24h進行）。BMSCs經(jīng)股靜脈注入，LPS行腹腔注射。觀察LPS注射后

11、24h內(nèi)各組大鼠生存情況，統(tǒng)計各組死亡時間，行統(tǒng)計學生存分析，繪制生存曲線。
　　 第五部分:為進一步明確BMSCs預處理的保護機制，我們對不同劑量BMSCs預處理后大鼠外周血淋巴細胞(PBMC)增殖能力的影響進行了測定，并在體外環(huán)境下研究了不同劑量同種異體BMSCs對LPS刺激PBMC增殖的影響，以及對炎性細胞因子產(chǎn)生的影響。
　　 結(jié)果:1，第1-5天，細胞快速生長，是增殖最快的時期，約第6天BMSCs增值達到頂峰，

12、此后維持小幅波動，總體顯示BMSCs生長旺盛。經(jīng)分化培養(yǎng)，BMSCs細胞可分化成為內(nèi)皮細胞，成骨細胞，脂肪細胞;經(jīng)流式細胞學檢測，BMSCsCD29，CD44，CD10，CD106表現(xiàn)陽性，而CD34，CD45表現(xiàn)陰性，符合骨髓間充質(zhì)干細胞分子表型特征;2，LPS注射組和對照組相比，血漿PLT數(shù)量明顯降低(P＜0.01)，F(xiàn)ib含量降低(P＜0.01），D-2聚體量偏高(P＜0.01），APTT(P＜0.01)和PT(P＜0.01)明顯

13、延長，而且腎臟，肺，肝臟，心臟組織切片經(jīng)HE染色和PTAH染色均提示有微血管血栓形成。LPS注射組發(fā)生DIC。3，慢病毒轉(zhuǎn)染293T細胞48小時后可見大量熒光，轉(zhuǎn)染效率良好。病毒轉(zhuǎn)染BMSCs后第5天，可見BMSCs熒光表達，BMSCs生長良好。不同MOI條件下病毒對BMSCs轉(zhuǎn)染的效率不同，當MOI為12.5時，轉(zhuǎn)染效率最高。經(jīng)靜脈注射GFP標記BMSCs三次后(每次間隔24h，劑量為1ml培養(yǎng)液含細胞數(shù)1×106)，取心肌組織切片，

14、抗GFP過氧化物酶染色呈陽性，提示心肌內(nèi)有BMSCs細胞存活。4，①和未經(jīng)BMSCs預處理組相比，BMSCs預處理組血漿PLT(P＜0.01)和Fib(P＜0.05)含量高，而D-2聚體含量偏低(P＜0.01），而且，APTT(P＜0.05)和PT(P＜0.01)延長偏短，凝血狀況較好;預處理BMSCs數(shù)量為1×105/次和1×106/次時最好。②與未經(jīng)BMSC預處理組相比，BMSCs預處理組血漿TNF-α(P＜0.01)、IFN-γ(

15、P＜0.01)、IL-1β(P＜0.05)濃度值均明顯偏低，而且組間比較具有統(tǒng)計學意義;在預處理BMSCs數(shù)量為1×105/次和1×106/次時，TNF-α，IFN-γ和IL-1β值最低。③與未經(jīng)BMSCs預處理組相比，BMSCs預處理組血漿ALT,Cr,CK-MB(P＞0.05)和ET(P＜0.05)濃度明顯降低;組間比較發(fā)現(xiàn)Cr和ET水平的差異具有統(tǒng)計學意義;預處理BMSCs數(shù)量為1×105/次和1×106/次時Cr和ET水平最低。

16、④各組腎臟，肺，肝臟，心臟組織切片經(jīng)HE染色和PTAH染色均顯示BMSCs預處理組器官纖維微血管血栓形成量較少，器官細胞損傷較小。預處理BMSCs數(shù)量為1×105/次和1×106/次時，纖維微血管血栓形成量最少，器官細胞損傷最輕。⑤BMSCs預處理對LPS誘導DIC大鼠的死亡事件的觀察，結(jié)果提示三組大鼠（每組n=20）24小時內(nèi)總生存率分別為:第一組34.2％，第二組51.3％，第三組64.5％，生存率比較P=0.02，有顯著統(tǒng)計學意義

17、;組間生存率比較，第一組VS第二組P=0.011，第一組VS第三組P=0.001，第二組VS第三組P=0.35。5，①和對照組相比，經(jīng)BMSCs預處理組大鼠PBMC在LPS刺激下的增殖能力明顯減弱。②LPS可明顯刺激PBMC的增殖，但在BMSCs的影響下，這種刺激作用明顯減弱(P＜0.05);在Transwell培養(yǎng)下，可達到同樣效果(P＜0.05)。LPS刺激后，培養(yǎng)液炎性因子的濃度明顯增加，但和BMSCs混合培養(yǎng)后，炎性因子釋放增加

18、的量明顯減少，在Transwell培養(yǎng)中也有同樣的表現(xiàn)。③和BMSCs混合培養(yǎng)時，LPS刺激PBMC的增殖明顯減少，隨著BMSCs數(shù)量越多，LPS刺激PBMC的增殖數(shù)量越來越少。和BMSCs混合培養(yǎng)時，培養(yǎng)液炎性因子的濃度開始減少，隨著BMSCs量的增加，炎性因子的濃度越來越低。當BMSCs增加到一定濃度時，PBMC增殖量不再減少，炎性因子濃度也不再降低。
　　 結(jié)論:1，用密度梯度法進行BMSCs分離，貼壁法和機械刮除法進行B

19、MSCs培養(yǎng)和體外擴增，可以獲得形態(tài)較單一的BMSCs樣細胞，細胞生長形態(tài)和狀況良好，經(jīng)流式細胞表型鑒定和多向分化培養(yǎng)鑒定證實為BMSCs。2，用LPS靜脈推注可成功誘導建立Wistar大鼠DIC模型。此法操作簡便，成功率高。LPS靜脈推注可作為建立大鼠DIC模型的可靠方法。3，用慢病毒載體可成功轉(zhuǎn)染GFP于大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞中，3次靜脈注射(每次間隔24h)本實驗所培養(yǎng)的GFP標記大鼠骨髓間充質(zhì)量干細胞后，可在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)存活的BMSC