骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)大鼠DIC模型的器官保護(hù)作用.pdf

1、研究目的:研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)預(yù)處理對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)模型大鼠的器官保護(hù)性作用并探討其機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 第一部分:取同種異體Wistar大鼠原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)出的骨髓干細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察，考察其增殖能力;通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)其細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定;在特定條件下培養(yǎng)BMSCs向內(nèi)皮細(xì)胞，成骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞的分化，以證實(shí)其潛在可塑性，進(jìn)一步確定其為BMSC

2、s。
　　 第二部分:LPS誘導(dǎo)Wistar大鼠DIC模型的建立。30只成年雄性Wistar大鼠，月齡7周，體重160-170g，分為2組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各15只，按劑量30mg/kg腹腔內(nèi)注射異戊巴比妥鈉麻醉后，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)尾靜脈或股靜脈緩慢注射2mlLPS(3mg/kg，1小時(shí))，而對(duì)照組給予等量生理鹽水。深麻醉下分別在LPS注射前及注射后4小時(shí)和8小時(shí)經(jīng)下腔靜脈抽取靜脈血，測(cè)定以下凝血參數(shù):血小板(PLT)數(shù)量，纖維蛋白原(F

3、ib)，部分凝血活酶時(shí)間(APTT)，凝血酶原時(shí)間(PT)，D-2聚體(D-D)。在LPS注射8小時(shí)后處死大鼠。取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠心臟，肝臟，腎臟，肺等主要器官的組織用10％甲醛固定24h，分別行HE染色和Mallory磷鎢酸蘇木精染色（PTAH染色），顯微鏡下觀察各臟器細(xì)胞形態(tài)，纖維血栓形成情況，并進(jìn)行對(duì)比;同時(shí)計(jì)數(shù)100個(gè)腎小球，觀察其中有纖維蛋白微血栓的腎小球所占比例，以判斷本組實(shí)驗(yàn)LPS能否成功誘導(dǎo)建立DIC模型。
　　

4、 第三部分:慢病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及體內(nèi)檢測(cè)。慢病毒載體(PGCL-GFP、pHelper1.0、pHelper2.0)包裝后獲取病毒的上清液保存。取第3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的大鼠BMSC5×104個(gè)，分別與0.25、2.5、5、12.5、25感染復(fù)數(shù)(MOI)的病毒液，在Polybrene液中(8g/ml)，32℃，1000g離心2小時(shí)，然后種于12孔板培養(yǎng)，每孔含10％FBS的DMEM1.5ml;12h后換液，此后每3天換

5、液1次并觀察BMSCs熒光表達(dá)情況;第5天每個(gè)孔取5個(gè)視野計(jì)算平均轉(zhuǎn)染率，了解MOI與轉(zhuǎn)染效率的關(guān)系，選擇最佳MOI。取月齡7周，體重160-170g成年雄性Wistar大鼠10只，經(jīng)大鼠尾靜脈或股靜脈注入1ml培養(yǎng)液（含有GFP標(biāo)記轉(zhuǎn)染5天后BMSCs數(shù)量約1×106）共3次，每次間隔24h，第3次注射24h后處死大鼠，取大鼠心臟組織，用10％甲醛固定24h，然后行HE及抗GFP過(guò)氧化物酶染色。觀察心肌組織內(nèi)是否有BMSCs存活。

6、r>　　 第四部分:上述實(shí)驗(yàn)成功后，取60只成年雄性Wistar大鼠，月齡7周，體重160-170g，按照BMSCs預(yù)處理和LPS注射方案不同分為6組，每組各有大鼠10只。處理組1:1ml培養(yǎng)液（不含BMSCs）注射3次，每次間隔24小時(shí)，進(jìn)行預(yù)處理。在最后一次預(yù)處理結(jié)束后24h，注射1mlLPS(劑量，3mg/kg)。處理組2:1ml培養(yǎng)液（含BMSCs1×103）注射3次，每次間隔24小時(shí)，進(jìn)行預(yù)處理。在最后一次預(yù)處理結(jié)束后24h

7、，注射1mlLPS(劑量，3mg/kg)。處理組3:1ml培養(yǎng)液（含BMSCs1×104）注射3次每次間隔24小時(shí)，進(jìn)行預(yù)處理。在最后一次預(yù)處理結(jié)束后24h，注射1mlLPS(劑量，3mg/kg)。處理組4:1ml培養(yǎng)液(含BMSCs1×105)注射3次每次間隔24小時(shí)，進(jìn)行預(yù)處理。在最后一次預(yù)處理結(jié)束后24h，注射1mlLPS(劑量，3mg/kg)。處理組5:1ml培養(yǎng)液（含BMSCs1×106）注射3次，每次間隔24小時(shí)，進(jìn)行預(yù)處理

8、。在最后一次預(yù)處理結(jié)束后24h，注射1mlLPS(劑量，3mg/kg)。對(duì)照組:1ml培養(yǎng)液，不含BMSCs，注射3次，每次間隔24小時(shí)。在最后一次注射后24h，注射生理鹽水1ml（不含LPS）。共6組。分別在LPS（或不含LPS）注入前及注入后4小時(shí)和8小時(shí)各抽取靜脈血，測(cè)量以下參數(shù):PLT，F(xiàn)ib，D-2聚體(D-D)，APTT，PT，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，干擾素-γ(IFN-γ)，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)，肌酐(C

9、r)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)，內(nèi)皮素(ET)。取心臟，肝臟，腎臟及肺部組織進(jìn)行HE染色及PTAH染色，檢測(cè)各器官組織細(xì)胞形態(tài)及微纖維血栓形成情況。為了進(jìn)一步證明BMSCs預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)DIC大鼠的保護(hù)作用，我們選擇另外60只成年雄性Wistar大鼠，月齡7周，體重160-170g，隨機(jī)分為三組，觀察短期內(nèi)大鼠死亡事件。為更好觀察短期內(nèi)大鼠死亡事件，我們加大LPS注射劑量至10mg/kg，觀察24小時(shí)

10、內(nèi)BMSCs預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)DIC的保護(hù)作用。第1組:LPS注射，(LPS10mg/kg);第2組:BMSCs預(yù)處理，（1×103/次×3次，每次間隔24小時(shí)）+LPS注射（10mg/kg，在BMSCs最后一次預(yù)處理結(jié)束后24h進(jìn)行）。第3組:BMSCs預(yù)處理，（1×105/次×3次，每次間隔24小時(shí)）+LPS注射（10mg/kg，在BMSCs最后一次預(yù)處理結(jié)束后24h進(jìn)行）。BMSCs經(jīng)股靜脈注入，LPS行腹腔注射。觀察LPS注射后

11、24h內(nèi)各組大鼠生存情況，統(tǒng)計(jì)各組死亡時(shí)間，行統(tǒng)計(jì)學(xué)生存分析，繪制生存曲線。
　　 第五部分:為進(jìn)一步明確BMSCs預(yù)處理的保護(hù)機(jī)制，我們對(duì)不同劑量BMSCs預(yù)處理后大鼠外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)增殖能力的影響進(jìn)行了測(cè)定，并在體外環(huán)境下研究了不同劑量同種異體BMSCs對(duì)LPS刺激PBMC增殖的影響，以及對(duì)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。
　　 結(jié)果:1，第1-5天，細(xì)胞快速生長(zhǎng)，是增殖最快的時(shí)期，約第6天BMSCs增值達(dá)到頂峰，

12、此后維持小幅波動(dòng)，總體顯示BMSCs生長(zhǎng)旺盛。經(jīng)分化培養(yǎng)，BMSCs細(xì)胞可分化成為內(nèi)皮細(xì)胞，成骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞;經(jīng)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，BMSCsCD29，CD44，CD10，CD106表現(xiàn)陽(yáng)性，而CD34，CD45表現(xiàn)陰性，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分子表型特征;2，LPS注射組和對(duì)照組相比，血漿PLT數(shù)量明顯降低(P＜0.01)，F(xiàn)ib含量降低(P＜0.01），D-2聚體量偏高(P＜0.01），APTT(P＜0.01)和PT(P＜0.01)明顯

13、延長(zhǎng)，而且腎臟，肺，肝臟，心臟組織切片經(jīng)HE染色和PTAH染色均提示有微血管血栓形成。LPS注射組發(fā)生DIC。3，慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48小時(shí)后可見(jiàn)大量熒光，轉(zhuǎn)染效率良好。病毒轉(zhuǎn)染BMSCs后第5天，可見(jiàn)BMSCs熒光表達(dá)，BMSCs生長(zhǎng)良好。不同MOI條件下病毒對(duì)BMSCs轉(zhuǎn)染的效率不同，當(dāng)MOI為12.5時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高。經(jīng)靜脈注射GFP標(biāo)記BMSCs三次后(每次間隔24h，劑量為1ml培養(yǎng)液含細(xì)胞數(shù)1×106)，取心肌組織切片，

14、抗GFP過(guò)氧化物酶染色呈陽(yáng)性，提示心肌內(nèi)有BMSCs細(xì)胞存活。4，①和未經(jīng)BMSCs預(yù)處理組相比，BMSCs預(yù)處理組血漿PLT(P＜0.01)和Fib(P＜0.05)含量高，而D-2聚體含量偏低(P＜0.01），而且，APTT(P＜0.05)和PT(P＜0.01)延長(zhǎng)偏短，凝血狀況較好;預(yù)處理BMSCs數(shù)量為1×105/次和1×106/次時(shí)最好。②與未經(jīng)BMSC預(yù)處理組相比，BMSCs預(yù)處理組血漿TNF-α(P＜0.01)、IFN-γ(

15、P＜0.01)、IL-1β(P＜0.05)濃度值均明顯偏低，而且組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在預(yù)處理BMSCs數(shù)量為1×105/次和1×106/次時(shí)，TNF-α，IFN-γ和IL-1β值最低。③與未經(jīng)BMSCs預(yù)處理組相比，BMSCs預(yù)處理組血漿ALT,Cr,CK-MB(P＞0.05)和ET(P＜0.05)濃度明顯降低;組間比較發(fā)現(xiàn)Cr和ET水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;預(yù)處理BMSCs數(shù)量為1×105/次和1×106/次時(shí)Cr和ET水平最低。

16、④各組腎臟，肺，肝臟，心臟組織切片經(jīng)HE染色和PTAH染色均顯示BMSCs預(yù)處理組器官纖維微血管血栓形成量較少，器官細(xì)胞損傷較小。預(yù)處理BMSCs數(shù)量為1×105/次和1×106/次時(shí)，纖維微血管血栓形成量最少，器官細(xì)胞損傷最輕。⑤BMSCs預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)DIC大鼠的死亡事件的觀察，結(jié)果提示三組大鼠（每組n=20）24小時(shí)內(nèi)總生存率分別為:第一組34.2％，第二組51.3％，第三組64.5％，生存率比較P=0.02，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

17、;組間生存率比較，第一組VS第二組P=0.011，第一組VS第三組P=0.001，第二組VS第三組P=0.35。5，①和對(duì)照組相比，經(jīng)BMSCs預(yù)處理組大鼠PBMC在LPS刺激下的增殖能力明顯減弱。②LPS可明顯刺激PBMC的增殖，但在BMSCs的影響下，這種刺激作用明顯減弱(P＜0.05);在Transwell培養(yǎng)下，可達(dá)到同樣效果(P＜0.05)。LPS刺激后，培養(yǎng)液炎性因子的濃度明顯增加，但和BMSCs混合培養(yǎng)后，炎性因子釋放增加

18、的量明顯減少，在Transwell培養(yǎng)中也有同樣的表現(xiàn)。③和BMSCs混合培養(yǎng)時(shí)，LPS刺激PBMC的增殖明顯減少，隨著B(niǎo)MSCs數(shù)量越多，LPS刺激PBMC的增殖數(shù)量越來(lái)越少。和BMSCs混合培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)液炎性因子的濃度開(kāi)始減少，隨著B(niǎo)MSCs量的增加，炎性因子的濃度越來(lái)越低。當(dāng)BMSCs增加到一定濃度時(shí)，PBMC增殖量不再減少，炎性因子濃度也不再降低。
　　 結(jié)論:1，用密度梯度法進(jìn)行BMSCs分離，貼壁法和機(jī)械刮除法進(jìn)行B

19、MSCs培養(yǎng)和體外擴(kuò)增，可以獲得形態(tài)較單一的BMSCs樣細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)和狀況良好，經(jīng)流式細(xì)胞表型鑒定和多向分化培養(yǎng)鑒定證實(shí)為BMSCs。2，用LPS靜脈推注可成功誘導(dǎo)建立Wistar大鼠DIC模型。此法操作簡(jiǎn)便，成功率高。LPS靜脈推注可作為建立大鼠DIC模型的可靠方法。3，用慢病毒載體可成功轉(zhuǎn)染GFP于大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，3次靜脈注射(每次間隔24h)本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的GFP標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)量干細(xì)胞后，可在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)存活的BMSC