TSA對骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化的促進作用及機制探討.pdf

1、目的：明確TSA是否對MSCs向心肌細胞分化有促進作用；探討MSCs向心肌細胞分化過程中乙酰化特異性調(diào)控的作用機制。 材料與方法： 1.細胞培養(yǎng)：取Wistar大鼠的股骨和脛骨骨髓，用貼壁法分離、培養(yǎng)、擴增體外MSCs；取Wistar大鼠新生鼠（1～3天）的心臟，用消化分離法、差速貼壁法及化學試劑抑制法分離、純化、培養(yǎng)心肌細胞。 2.誘導實驗：本實驗分為兩組即原始對照組（MSCs）、誘導組（包括與心肌細胞共培養(yǎng)和

2、5-aza誘導兩種方式）。檢測指標：（1）采用基于SYBR.GREENI法的實時熒光定量PCR檢測心肌細胞早期轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、NKx2.5、MEF2c；（2）免疫熒光觀察心肌特異性蛋白MHC、CX43、cTnT表達變化；（3）Western-blot分析心肌特異性肌鈣蛋白T（cardiac muscle Troponin T cTnT）表達量。 3.誘導后干預實驗：（1）5-氮胞苷誘導MSCs細胞；（2）用transwe

3、ll插入式培養(yǎng)皿構(gòu)建MSCs和心肌細胞共培養(yǎng)模式。兩組細胞分別用不同濃度的去乙?；敢种苿㏕SA進行干預。檢測指標同上。 4.機制探討實驗：應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）沉淀出與Gcn5蛋白結(jié)合的心肌細胞相關(guān)基因，設(shè)計針對心肌細胞特異基因GATA-4、NKx2.5、MEF2c的DNA引物，實時熒光定量PCR檢測幾種基因的表達。 結(jié)果： 1.MSCs及心肌細胞培養(yǎng)狀況SCs接種24小時后開始貼壁生長，可見稀少

4、的呈長梭形的貼壁細胞3～4天后開始集落樣增殖，梭形貼壁細胞開始增多，集落周圍的貼壁細胞逐漸開始融合；傳代后細胞呈束狀、漩渦狀排列，隨著換液與傳代，MSCs逐漸得到純化。分離的心肌細胞貼壁生長第3天細胞相互接觸交織，逐漸形成細胞簇或細胞單層，鏡下不同視野下可見搏動的細胞團（含單個自發(fā)搏動的細胞），搏動呈同步性，搏動頻率在40～60次/min。1周后大量細胞成團收縮，同時成纖維細胞開始生長。 2.共培養(yǎng)誘導組：MSCs與心肌細胞共培

5、養(yǎng)1周，實時熒光定量PCR檢測心肌細胞早期轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果顯示心肌細胞早期轉(zhuǎn)錄因子GA TA-4、NKx2.5和MEF2c出現(xiàn)表達；免疫熒光顯色心肌細胞特異蛋白，在MSCs胞漿可見心肌特異蛋白cTnT及CX43和MHC表達；Western-blot檢測出現(xiàn)cTnT的表達。5-aza誘導組：MSCs經(jīng)5-aza誘導實時熒光定量PCR顯示心肌細胞早期轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、NKx2.5和MEF2c出現(xiàn)表達；Western-blot檢測MSCs也

6、出現(xiàn)cTnT的表達。 3.誘導后干預實驗：共培養(yǎng)和經(jīng)不同濃度TSA干預：實時熒光定量PCR檢測心肌細胞早期轉(zhuǎn)錄因子，TSA500nmol/L濃度與其余兩組不同濃度TSA比較表達最高，差異有顯著性（P<0.05）；而因子GATA-4和MEF2c在100nmol/L與300nmol/L組間比較沒有顯著差異性。NKx2.5的表達在一定濃度范圍隨TSA濃度增加呈上調(diào)趨勢差異有顯著性（P<0.05）；免疫熒光檢測MSCs向心肌樣細胞分化率

7、，胞漿可見心肌特異性蛋白cTnT和CX43出現(xiàn)表達，隨培養(yǎng)時間延長和TSA干預濃度提高，MSCs的分化率逐步提高，但提高幅度較低。Western-blot檢測cTnT的表達量，共培養(yǎng)及干預組都比MSCs組有提高，共培養(yǎng)組與干預組間比較，100nmol/L、300nmol/L、500nmol/L都比共培養(yǎng)組有提高；TSA干預組間比較，500nmol/L濃度與其余兩組不同濃度TSA比較表達最高，差異有顯著性（P<0.05）；100nmol/

8、L與300nmol/L之間比較沒有顯著差異性。5-aza誘導和不同濃度TSA干預：心肌早期轉(zhuǎn)錄因子表達水平和心肌特異性蛋白cTnT組間比較，差異有顯著性（P<0.05），在一定濃度范圍表達隨TSA濃度增加呈正相關(guān)。Western-blot檢測cTnT的表達量，經(jīng)三種不同濃度（100nmol/L、300nmo/L、500nmoVL）TSA干預后與5-aza誘導組比較，在一定濃度范圍內(nèi)蛋白表達量上調(diào)，各組間比較TSA100 nmol/L與3

9、00 nmol/L；TSA100 nmol/L與TSA500nmol/L；TSA300 nmol/L與TSA500 nmol/L組間比較差異有顯著性（P<0.05）。 4.利用ChIP技術(shù)沉淀出與Gcn5蛋白一起結(jié)合的核酸-蛋白復合物，實時熒光定量PCR檢測到該核酸中有心肌早期發(fā)育特異基因GATA-4、NKx2.5的DNA啟動子表達。 結(jié)論： 1.HDAC酶抑制劑TSA對MSCs向心肌樣細胞分化有促進作用，在一定