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文檔簡介
1、目的:明確TSA是否對MSCs向心肌細胞分化有促進作用;探討MSCs向心肌細胞分化過程中乙?;禺愋哉{控的作用機制。 材料與方法: 1.細胞培養(yǎng):取Wistar大鼠的股骨和脛骨骨髓,用貼壁法分離、培養(yǎng)、擴增體外MSCs;取Wistar大鼠新生鼠(1~3天)的心臟,用消化分離法、差速貼壁法及化學試劑抑制法分離、純化、培養(yǎng)心肌細胞。 2.誘導實驗:本實驗分為兩組即原始對照組(MSCs)、誘導組(包括與心肌細胞共培養(yǎng)和
2、5-aza誘導兩種方式)。檢測指標:(1)采用基于SYBR.GREENI法的實時熒光定量PCR檢測心肌細胞早期轉錄因子GATA-4、NKx2.5、MEF2c;(2)免疫熒光觀察心肌特異性蛋白MHC、CX43、cTnT表達變化;(3)Western-blot分析心肌特異性肌鈣蛋白T(cardiac muscle Troponin T cTnT)表達量。 3.誘導后干預實驗:(1)5-氮胞苷誘導MSCs細胞;(2)用transwe
3、ll插入式培養(yǎng)皿構建MSCs和心肌細胞共培養(yǎng)模式。兩組細胞分別用不同濃度的去乙酰化酶抑制劑TSA進行干預。檢測指標同上。 4.機制探討實驗:應用染色質免疫共沉淀技術(ChIP)沉淀出與Gcn5蛋白結合的心肌細胞相關基因,設計針對心肌細胞特異基因GATA-4、NKx2.5、MEF2c的DNA引物,實時熒光定量PCR檢測幾種基因的表達。 結果: 1.MSCs及心肌細胞培養(yǎng)狀況SCs接種24小時后開始貼壁生長,可見稀少
4、的呈長梭形的貼壁細胞3~4天后開始集落樣增殖,梭形貼壁細胞開始增多,集落周圍的貼壁細胞逐漸開始融合;傳代后細胞呈束狀、漩渦狀排列,隨著換液與傳代,MSCs逐漸得到純化。分離的心肌細胞貼壁生長第3天細胞相互接觸交織,逐漸形成細胞簇或細胞單層,鏡下不同視野下可見搏動的細胞團(含單個自發(fā)搏動的細胞),搏動呈同步性,搏動頻率在40~60次/min。1周后大量細胞成團收縮,同時成纖維細胞開始生長。 2.共培養(yǎng)誘導組:MSCs與心肌細胞共培
5、養(yǎng)1周,實時熒光定量PCR檢測心肌細胞早期轉錄因子,結果顯示心肌細胞早期轉錄因子GA TA-4、NKx2.5和MEF2c出現(xiàn)表達;免疫熒光顯色心肌細胞特異蛋白,在MSCs胞漿可見心肌特異蛋白cTnT及CX43和MHC表達;Western-blot檢測出現(xiàn)cTnT的表達。5-aza誘導組:MSCs經5-aza誘導實時熒光定量PCR顯示心肌細胞早期轉錄因子GATA-4、NKx2.5和MEF2c出現(xiàn)表達;Western-blot檢測MSCs也
6、出現(xiàn)cTnT的表達。 3.誘導后干預實驗:共培養(yǎng)和經不同濃度TSA干預:實時熒光定量PCR檢測心肌細胞早期轉錄因子,TSA500nmol/L濃度與其余兩組不同濃度TSA比較表達最高,差異有顯著性(P<0.05);而因子GATA-4和MEF2c在100nmol/L與300nmol/L組間比較沒有顯著差異性。NKx2.5的表達在一定濃度范圍隨TSA濃度增加呈上調趨勢差異有顯著性(P<0.05);免疫熒光檢測MSCs向心肌樣細胞分化率
7、,胞漿可見心肌特異性蛋白cTnT和CX43出現(xiàn)表達,隨培養(yǎng)時間延長和TSA干預濃度提高,MSCs的分化率逐步提高,但提高幅度較低。Western-blot檢測cTnT的表達量,共培養(yǎng)及干預組都比MSCs組有提高,共培養(yǎng)組與干預組間比較,100nmol/L、300nmol/L、500nmol/L都比共培養(yǎng)組有提高;TSA干預組間比較,500nmol/L濃度與其余兩組不同濃度TSA比較表達最高,差異有顯著性(P<0.05);100nmol/
8、L與300nmol/L之間比較沒有顯著差異性。5-aza誘導和不同濃度TSA干預:心肌早期轉錄因子表達水平和心肌特異性蛋白cTnT組間比較,差異有顯著性(P<0.05),在一定濃度范圍表達隨TSA濃度增加呈正相關。Western-blot檢測cTnT的表達量,經三種不同濃度(100nmol/L、300nmo/L、500nmoVL)TSA干預后與5-aza誘導組比較,在一定濃度范圍內蛋白表達量上調,各組間比較TSA100 nmol/L與3
9、00 nmol/L;TSA100 nmol/L與TSA500nmol/L;TSA300 nmol/L與TSA500 nmol/L組間比較差異有顯著性(P<0.05)。 4.利用ChIP技術沉淀出與Gcn5蛋白一起結合的核酸-蛋白復合物,實時熒光定量PCR檢測到該核酸中有心肌早期發(fā)育特異基因GATA-4、NKx2.5的DNA啟動子表達。 結論: 1.HDAC酶抑制劑TSA對MSCs向心肌樣細胞分化有促進作用,在一定
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