TSA對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的促進(jìn)作用及機(jī)制探討.pdf

1、目的：明確TSA是否對(duì)MSCs向心肌細(xì)胞分化有促進(jìn)作用；探討MSCs向心肌細(xì)胞分化過程中乙酰化特異性調(diào)控的作用機(jī)制。 材料與方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)：取Wistar大鼠的股骨和脛骨骨髓，用貼壁法分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增體外MSCs；取Wistar大鼠新生鼠（1～3天）的心臟，用消化分離法、差速貼壁法及化學(xué)試劑抑制法分離、純化、培養(yǎng)心肌細(xì)胞。 2.誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)分為兩組即原始對(duì)照組（MSCs）、誘導(dǎo)組（包括與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)和

2、5-aza誘導(dǎo)兩種方式）。檢測(cè)指標(biāo)：（1）采用基于SYBR.GREENI法的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞早期轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、NKx2.5、MEF2c；（2）免疫熒光觀察心肌特異性蛋白MHC、CX43、cTnT表達(dá)變化；（3）Western-blot分析心肌特異性肌鈣蛋白T（cardiac muscle Troponin T cTnT）表達(dá)量。 3.誘導(dǎo)后干預(yù)實(shí)驗(yàn)：（1）5-氮胞苷誘導(dǎo)MSCs細(xì)胞；（2）用transwe

3、ll插入式培養(yǎng)皿構(gòu)建MSCs和心肌細(xì)胞共培養(yǎng)模式。兩組細(xì)胞分別用不同濃度的去乙酰化酶抑制劑TSA進(jìn)行干預(yù)。檢測(cè)指標(biāo)同上。 4.機(jī)制探討實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）沉淀出與Gcn5蛋白結(jié)合的心肌細(xì)胞相關(guān)基因，設(shè)計(jì)針對(duì)心肌細(xì)胞特異基因GATA-4、NKx2.5、MEF2c的DNA引物，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)幾種基因的表達(dá)。 結(jié)果： 1.MSCs及心肌細(xì)胞培養(yǎng)狀況SCs接種24小時(shí)后開始貼壁生長(zhǎng)，可見稀少

4、的呈長(zhǎng)梭形的貼壁細(xì)胞3～4天后開始集落樣增殖，梭形貼壁細(xì)胞開始增多，集落周圍的貼壁細(xì)胞逐漸開始融合；傳代后細(xì)胞呈束狀、漩渦狀排列，隨著換液與傳代，MSCs逐漸得到純化。分離的心肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)第3天細(xì)胞相互接觸交織，逐漸形成細(xì)胞簇或細(xì)胞單層，鏡下不同視野下可見搏動(dòng)的細(xì)胞團(tuán)（含單個(gè)自發(fā)搏動(dòng)的細(xì)胞），搏動(dòng)呈同步性，搏動(dòng)頻率在40～60次/min。1周后大量細(xì)胞成團(tuán)收縮，同時(shí)成纖維細(xì)胞開始生長(zhǎng)。 2.共培養(yǎng)誘導(dǎo)組：MSCs與心肌細(xì)胞共培

5、養(yǎng)1周，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞早期轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果顯示心肌細(xì)胞早期轉(zhuǎn)錄因子GA TA-4、NKx2.5和MEF2c出現(xiàn)表達(dá)；免疫熒光顯色心肌細(xì)胞特異蛋白，在MSCs胞漿可見心肌特異蛋白cTnT及CX43和MHC表達(dá)；Western-blot檢測(cè)出現(xiàn)cTnT的表達(dá)。5-aza誘導(dǎo)組：MSCs經(jīng)5-aza誘導(dǎo)實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示心肌細(xì)胞早期轉(zhuǎn)錄因子GATA-4、NKx2.5和MEF2c出現(xiàn)表達(dá)；Western-blot檢測(cè)MSCs也

6、出現(xiàn)cTnT的表達(dá)。 3.誘導(dǎo)后干預(yù)實(shí)驗(yàn)：共培養(yǎng)和經(jīng)不同濃度TSA干預(yù)：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞早期轉(zhuǎn)錄因子，TSA500nmol/L濃度與其余兩組不同濃度TSA比較表達(dá)最高，差異有顯著性（P<0.05）；而因子GATA-4和MEF2c在100nmol/L與300nmol/L組間比較沒有顯著差異性。NKx2.5的表達(dá)在一定濃度范圍隨TSA濃度增加呈上調(diào)趨勢(shì)差異有顯著性（P<0.05）；免疫熒光檢測(cè)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化率

7、，胞漿可見心肌特異性蛋白cTnT和CX43出現(xiàn)表達(dá)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)和TSA干預(yù)濃度提高，MSCs的分化率逐步提高，但提高幅度較低。Western-blot檢測(cè)cTnT的表達(dá)量，共培養(yǎng)及干預(yù)組都比MSCs組有提高，共培養(yǎng)組與干預(yù)組間比較，100nmol/L、300nmol/L、500nmol/L都比共培養(yǎng)組有提高；TSA干預(yù)組間比較，500nmol/L濃度與其余兩組不同濃度TSA比較表達(dá)最高，差異有顯著性（P<0.05）；100nmol/

8、L與300nmol/L之間比較沒有顯著差異性。5-aza誘導(dǎo)和不同濃度TSA干預(yù)：心肌早期轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平和心肌特異性蛋白cTnT組間比較，差異有顯著性（P<0.05），在一定濃度范圍表達(dá)隨TSA濃度增加呈正相關(guān)。Western-blot檢測(cè)cTnT的表達(dá)量，經(jīng)三種不同濃度（100nmol/L、300nmo/L、500nmoVL）TSA干預(yù)后與5-aza誘導(dǎo)組比較，在一定濃度范圍內(nèi)蛋白表達(dá)量上調(diào)，各組間比較TSA100 nmol/L與3

9、00 nmol/L；TSA100 nmol/L與TSA500nmol/L；TSA300 nmol/L與TSA500 nmol/L組間比較差異有顯著性（P<0.05）。 4.利用ChIP技術(shù)沉淀出與Gcn5蛋白一起結(jié)合的核酸-蛋白復(fù)合物，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)到該核酸中有心肌早期發(fā)育特異基因GATA-4、NKx2.5的DNA啟動(dòng)子表達(dá)。 結(jié)論： 1.HDAC酶抑制劑TSA對(duì)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化有促進(jìn)作用，在一定