JAK-STAT信號通路在氧化應激預處理的適應性神經保護中的作用.pdf

1、神經系統(tǒng)疾病對人類健康的危害很大。中樞神經系統(tǒng)不同疾病的生理病理機制雖然各不相同，但近年的研究表明，腦缺血、腦出血、癲癇、腦外傷、缺氧性腦病，神經系統(tǒng)變性及退行性變等神經系統(tǒng)疾病均具有某些相似或共同的生理病理機制，均存在細胞壞死和凋亡。神經保護已成為21世紀神經病學研究的重點。 氧化應激(oxidativestress)是指機體內氧自由基的產生與消除失去平衡，或外源性的過量攝入，導致活性氧(ReactiveOxygenSpeci

2、es，ROS)在體內堆積引起細胞毒性。ROS生成增多，可觸發(fā)神經細胞的興奮性毒性和凋亡這兩個導致神經元死亡的主要因素。闡明氧化應激在神經損傷以及神經退行性疾病中的作用，能為許多神經系統(tǒng)疾病提供新的治療措施。 第一部分H2O2預處理的適應性神經保護作用研究 目的：探討H2O2預處理對PC12細胞抗氧化應激損傷的適應性神經保護作用。 研究方法： 1.Hochest染色檢測PC12細胞凋亡。 2.PI染

3、色流式細胞儀(Flowcytometry，FCM)檢測PC12細胞凋亡。 3.MTT檢測PC12細胞存活率。 研究結果： 1.H2O2損傷濃度與時間的確定： ①用100-500μmol/L的H2O2處理PC12細胞，引起PC12細胞的凋亡具有劑量依賴性的關系。②為了進一步確定300μmol/LH2O2在24h內對PC12細胞凋亡的影響，我們選取了不同時間段(4h、8h、12h、18h和24h)來觀察PC1

4、2細胞的凋亡情況。 根據以上的實驗結果，本文選定H2O2的損傷濃度為300μmol/L，損傷時間為12h，開展以后的研究工作。 2.H202預處理濃度、時間與間隔的確定： ①H2O2預處理濃度的確定：上述實驗結果表明，H2O2對PC12細胞的損傷具有劑量-時間依賴性的特點，100μmol/LH2O2對PC12細胞幾乎無損傷作用(p＞0.05)，所以選擇100μmol/L為H2O2的預處理濃度。 ②預處理時

5、間的確定：有文獻報道，幾次短暫的腦缺血預處理后，最強的腦保護作用發(fā)生在間隔24h后，因此本文選擇24h為預處理間隔，考查預處理的時間。結果顯示，100μmol/LH2O2預處理90rmin，間隔24h，可以明顯抑制由300μmol/LH2O2誘導的PC12細胞的凋亡，細胞凋亡率由(65.83±2.06)％(44.63±3.35)％(p＜0.05)。而預處理30min、60min和120min組的凋亡率與損傷組相比，，沒有統(tǒng)計學差異(p＞

6、0.05)。因此本文確定90min為預處理時間。 ③預處理間隔的確定：上述結果表明，H2O2預處理90min，間隔24h組，細胞凋亡率為(44.63±3.35)％(p＜0.05)，可以明顯對抗300μmol/LH2O2誘導的PC12細胞的凋亡，為進一步確定預處理的間隔時間，本文分別觀察預處理間隔為12h和36h時，H2O2預處理抗細胞凋亡的作用。結果表明，預處理間隔12h組和36h組的細胞凋亡率，與損傷組相比，p＞0.05，無統(tǒng)

7、計學差異。提示：100μmol/LH2O2預處理PC12細胞90min后，間隔24h能產生明顯的細胞保護作用。綜合以上的實驗結果，本研究以100μmol/L作為H2O2的預處理濃度，90min作為H2O2的預處理時間，24h作為H2O2的預處理間隔，開展后續(xù)的研究工作。 3.H202預處理對PC12細胞抗氧化應激損傷的適應性神經保護作用： ①經Hochest熒光染色后，在熒光顯微鏡下觀察到，對照組PC12細胞染色質分布均

8、勻，為彌漫均勻的低強度熒光；經300μmol/LH2O2處理12h后，未經100μmol/LH2O2預處理的PC12細胞，呈現出典型的凋亡特征，大量的細胞核呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光；經100μmol/LH2O2預處理90min的PC12細胞，能對抗由300μmol/LH2O2引起的損傷，其中細胞核呈濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡細胞明顯減少。100μmol/LH2O2預處理本身不引起細胞凋亡。 ②我們通過對凋亡圖譜

9、中亞二倍體峰的定量分析發(fā)現，經300μmol/LH2O2處理12h后，未經100μmol/LH2O2預處理的PC12細胞，其凋亡率增加到(65.80±3.20)％(p＜0.01)；經100μmol/LH2O2預處理的PC12細胞，其凋亡率由300μmol/L組的(65.8±3.20)％降低到(44.3±3.30)％(p＜0.01)；100μmol/LH2O2預處理本身不引起細胞凋亡。以上結果充分表明，H2O2預處理能夠對抗高濃度H2O2

10、誘導的PC12細胞的凋亡。 ③MTT細胞存活率的實驗結果同樣驗證了以上的結論。 綜合以上Hochest染色的凋亡細胞形態(tài)學的實驗結果、FCM流式細胞儀定量檢測凋亡細胞的實驗結果以及MTT對細胞存活率的檢測結果，本研究證實，100μmol/L的H2O2預處理PC12細胞90min，間隔24h，可以對抗隨后給予的高濃度(300μmol/L)H2O2誘導的PC12細胞的凋亡，產生顯著的適應性神經保護作用。 結論：H2O

11、2預處理能使PC12細胞對抗氧化應激損傷，產生明顯的適應性神經保護作用。 第二部分JAK/STAT信號通路在H2O2預處理的適應性神經保護中的作用研究 目的：探討JAK/STAT途徑、iNOS和COX-2在氧化應激預處理的適應性神經保護中的作用；闡明JAK/STAT途徑分別與iNOS和COX-2在氧化應激預處理的適應性神經保護作用中的關系。研究方法：1.Westernblot定性定量分析各種蛋白被H2O2預處理激活的情況

12、。 2.Hochest染色檢測PC12細胞凋亡。 3.PI染色流式細胞儀(Flowcytometry，FCM)檢測PC12細胞凋亡。 4.MTT檢測PC12細胞存活率。 研究結果：1.JAK/STAT信號通路介導了H2O2預處理的適應性神經保護作用①100μmol/LH2O2預處理PC12細胞90min后，誘導了JAK2的快速表達和酪氨酸磷酸化，但沒有激活JAK1。 ②JAK2活性的上調和酪氨酸磷

13、酸化誘導了STAT1和STAT3的酪氨酸磷酸化以及核轉移。 ③在H2O2預處理前20min給予JAK2的特異性抑制劑AG-490(10μmol/L)，可以完全阻斷H2O2預處理對JAK/STAT通路的激活，不但阻斷了JAK2的上調和酪氨酸磷酸化，而且阻斷了STAT1和STAT3的酪氨酸磷酸化以及核轉移。 ④在H2O2預處理前20min給予JAK2的特異性抑制劑AG-490(10μmol/L)，可以阻斷H2O2預處理抗PC

14、12細胞凋亡的細胞保護作用，使PC12細胞的凋亡率明顯增加，存活率減少。 以上結果充分證實，H2O2預處理能激活JAK/STAT信號通路，表明JAK/STAT信號通路參與了H2O2預處理誘導的適應性神經保護作用。 2.JAK/STAT信號通路通過iNOS介導H2O2預處理的適應性神經保護作用：①10μmol/LH2O2預處理，可以明顯上調iNOS的表達。 ②在H2O2預處理前20min給予iNOS的特異性抑制劑A

15、G(10μmol/L)，不但可以阻斷iNOS的表達上調，而且可以取消H2O2預處理的適應性神經保護作用，表明iNOS參與了H2O2預處理的適應性神經保護作用。 ③進一步的研究表明，JAK/STAT信號通路的特異性抑制劑AG-490(10μmol/L)，可以明顯抑制H2O2預處理誘導的iNOS表達上調(p＜0.01)。 結果表明，H2O2預處理可以激活iNOS，JAK/STAT信號通路可通過iNOS介導H2O2預處理的適應

16、性神經保護作用。 3.JAK/STAT信號通路通過COX-2介導H2O2預處理的適應性神經保護作用：①100μmol/LH2O2預處理，可以誘導COX-2的表達顯著上調。 ②在預處理前20min給予COX-2的特異性抑制劑NS-398(10μmol/L)，不僅可以完全阻斷COX-2的表達，而且可以明顯取消H2O2預處理的適應性神經保護作用。 ③在預處理前20min給予JAK2的特異性抑制劑AG-490(10pmo

17、l/L)，可以明顯抑制由H2O2預處理誘導的COX-2的表達上調(p＜0.01)。 結果表明：H2O2預處理可以激活COX-2，JAK/STAT信號通路通過COX-2介導H2O2預處理的適應性神經保護作用。 結論： 1.JAK/STAT信號通路介導了H2O2預處理的適應性神經保護作用。 2.JAK/STAT信號通路通過iNOS介導了H2O2預處理的適應性神經保護作用。 3.JAK/STAT信號通路