骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)組織擴(kuò)張的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:組織擴(kuò)張技術(shù)是修復(fù)重建的重要手段。然而其提供的皮膚組織量有限,很難滿足大面積缺損修復(fù)的需要。此外,部分患者皮膚再生能力極其有限,即使延長擴(kuò)張時間及增加擴(kuò)張量,仍然無法獲得足夠的組織用于修復(fù)。這些問題一直困擾著臨床醫(yī)生,并且限制了此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用。本課題將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的再生醫(yī)學(xué)治療手段應(yīng)用于組織擴(kuò)張,以檢測其是否可以有效的促進(jìn)組織擴(kuò)張,從而為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　 方法：(1)利用密度梯度離心法分離骨髓中的單個核細(xì)

2、胞,利用貼壁培養(yǎng)法,培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。細(xì)胞傳至3代,達(dá)到80％融合后用于移植。(2)以Wistar大鼠為組織擴(kuò)張動物模型。將大鼠分為對照組,擴(kuò)張過程中在擴(kuò)張皮膚中注射DMEM培養(yǎng)液,BM-MSCs組,擴(kuò)張過程中,皮瓣中注射移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)及BM-MNCs組,擴(kuò)張過程中皮膚中注射移植骨髓單個核細(xì)胞(BM-MNCs)?？刂谱畲髷U(kuò)張量為100ml,擴(kuò)張囊內(nèi)壓為60mmHg的條件下每周進(jìn)行擴(kuò)張。測量同一囊內(nèi)壓下各組擴(kuò)張

3、量及擴(kuò)張面積。記錄各組達(dá)到額定擴(kuò)張量所用的時間,并于擴(kuò)張后1周,2周及4周收集組織進(jìn)行HE染色、免疫組化、流式周期分析、ELISA等檢測。(3)體外實(shí)驗(yàn)對BM-MSCs和BM-MNCs進(jìn)行RNA水平及蛋白水平的檢測,以對其治療機(jī)制進(jìn)行探討。(4)利用RNA干擾技術(shù),對BM-MSCs分泌的EGF進(jìn)行阻斷,并開展體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證EGF在BM-MSCs促進(jìn)擴(kuò)張皮膚再生中起到的作用。
　　 結(jié)果：BM-MSCs組具有更高的擴(kuò)張量,并

4、且平均在27天達(dá)到額定擴(kuò)張量,而對照組和BM-MNCs組則需要42天。BM-MSCs組皮膚再生更加明顯,主要表現(xiàn)為細(xì)胞增殖明顯,膠原合成及生長因子分泌增加和血管化程度加強(qiáng)。移植細(xì)胞示蹤顯示,植入的BM-MSCs出現(xiàn)在表皮層,皮膚附屬組織中、表皮基底層及表皮真皮交界,而移植后的MNC主要位于皮下組織中,這說明BM-MSCs可能直接參與皮膚再生。細(xì)胞學(xué)研究表明BM-MSCs可以在RNA水平及蛋白水平高表達(dá)EGF。BM-MSCs培養(yǎng)基上清液可

5、以促進(jìn)體外培養(yǎng)的表皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞增殖,此種促進(jìn)增殖的作用可以被EGF中和抗體所阻斷。EGF干擾后的BM-MSCs移植,其促進(jìn)組織擴(kuò)張的作用顯著減弱。
　　 結(jié)論：BM-MSCs移植促進(jìn)牽張皮膚再生,從而加快組織擴(kuò)張。BM-MSCs促進(jìn)擴(kuò)張皮膚再生的作用一方面與其參與皮膚成分有關(guān),更為重要的是其可以分泌EGF.
　　 目的:皮瓣的壞死一直是困擾醫(yī)生的難題,如果能夠提前促進(jìn)皮瓣的血管化,將有效促進(jìn)皮瓣成活。本課題將骨

6、髓單個核細(xì)胞(BM-MNCs)應(yīng)用于缺血皮瓣,以檢測其是否可以促進(jìn)擴(kuò)張皮瓣的血管化,從而提高皮瓣存活率。
　　 方法：30只近交系Wistar大鼠隨機(jī)分成3組,對照組,脂肪干細(xì)胞(ADSCs)移植組和骨髓單個核細(xì)胞(BM-MNCs)移植組。于大鼠背部設(shè)計形成面積為9cm x3cm的皮瓣。在皮瓣形成區(qū)域多點(diǎn)注射DMEM培養(yǎng)液(對照組),注射移植ADSCs(ADSCs組),注射移植BM-MNCs(BM-MNCs組)。細(xì)胞移植后48h

7、,掀起皮瓣,并于術(shù)后一周收集皮瓣組織檢測。
　　 結(jié)果：術(shù)后皮瓣成活率分別為BM-MNCs組50.06±13.82％,ADSCs組46.33±13.46％,兩組均顯著高于對照組的26.33±7.14％。(p<0.05)BM-MNCs組與ADSCs組之間差異無顯著性。組織學(xué)顯示,BM-MNCs組皮瓣血管化程度增高。通過對細(xì)胞進(jìn)行示蹤發(fā)現(xiàn)少量植入體內(nèi)的BM-MNCs出現(xiàn)在血管結(jié)構(gòu)中。ELISA檢測顯示,BM-MNCs組皮瓣中VEGF