氧化應(yīng)激對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞保存活性的影響及對(duì)策的研究.pdf

1、背景
　　人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilicalcordmesenchymalstemcells,UC-MSCs）應(yīng)用廣泛，已深入到臨床試驗(yàn)階段。在用UC-MSCs進(jìn)行移植治療時(shí)會(huì)遇到很多問(wèn)題，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和我們先前的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，UC-MSCs經(jīng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)擴(kuò)增到臨床輸注環(huán)節(jié)眾多，如分離培養(yǎng)前的組織采集、培養(yǎng)過(guò)程、移植前保存、運(yùn)輸?shù)?，這些環(huán)節(jié)都會(huì)對(duì)移植前細(xì)胞的質(zhì)量產(chǎn)生不同程度的影響，而其中影響最直接和關(guān)鍵的是保存條件，特別是移植前細(xì)

2、胞在移植媒介中存放的時(shí)間長(zhǎng)短。在實(shí)際操作中并不能將新鮮分離的干細(xì)胞即刻輸注入體內(nèi)，如出現(xiàn)運(yùn)輸、手術(shù)等待等因素時(shí)均需將細(xì)胞在美國(guó)食品和藥物管理局（FoodandDrugAdministration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的保存介質(zhì)中保存一定時(shí)間，目前臨床移植常用的保存液生理鹽水可使UC-MSCs活性下降，影響移植效果，但關(guān)于其活性下降原因的報(bào)道目前還很少。尋找致使臨床移植保存液中UC-MSCs活性下降的原因，可針對(duì)性的為臨床常用移植保存液的優(yōu)化提供

3、理論依據(jù)，也為UC-MSCs的最適移植保存介質(zhì)的研究提供基礎(chǔ)。
　　目的
　　1.建立穩(wěn)定的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展提供可靠的、穩(wěn)定的細(xì)胞來(lái)源；
　　2.探索氧化應(yīng)激是否為UC-MSCs臨床移植保存過(guò)程中活性下降的因素；并在保存液中添加自由基清除劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）后是否可提高保存效果而且不影響UC-MSCs的特性。
　　方法
　　1.根據(jù)臍帶的結(jié)

4、構(gòu)和組成成分，選擇胰蛋白酶、II型膠原酶、IV型膠原酶、透明質(zhì)酸酶和DNAase五酶聯(lián)合（以下簡(jiǎn)稱(chēng)五酶法）消化臍帶組織分離培養(yǎng)UC-MSCs的方法來(lái)分離培養(yǎng)干細(xì)胞，對(duì)所獲得的細(xì)胞按照現(xiàn)行國(guó)際認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定：①形態(tài)特征觀察；②細(xì)胞表面標(biāo)記；③多向分化潛能鑒定。
　　2.室溫（24℃）下用生理鹽水保存UC-MSCs，0h、2h、4h、6h后分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、細(xì)胞裂解液中丙二醛含量以及三種常見(jiàn)抗氧化酶活性；在保存液中添加不同

5、濃度的NAC，通過(guò)CCK-8法判斷NAC的最適添加濃度。在保存液中添加最適NAC濃度后，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞貼壁率變化來(lái)判斷NAC對(duì)UC-MSCs活性的影響，從而判斷NAC對(duì)細(xì)胞活性的改善情況。最后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和誘導(dǎo)分化來(lái)鑒定NAC是否會(huì)影響干細(xì)胞特性。
　　結(jié)果
　　1.用五酶分離培養(yǎng)UC-MSCs的方法所獲得的細(xì)胞符合MSCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)；
　　2.經(jīng)生理鹽水保存后UC-MSCs內(nèi)活性氧水平升高；細(xì)胞裂解液丙二醛含量升高?？?/p>

6、氧化酶類(lèi)：超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性均降低。添加NAC的移植保存液組較之不添加組保存UC-MSCs后細(xì)胞活性氧水平顯著降低、貼壁率升高。保存液中添加NAC后，經(jīng)保存的UC-MSCs經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面標(biāo)志分子符合干細(xì)胞特性，可誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。
　　結(jié)論
　　1.五酶聯(lián)合消化法所獲得的細(xì)胞符合MSCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)，可為后續(xù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定可靠的細(xì)胞來(lái)源；