雄激素在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)過程中的作用及信號機(jī)制研究.pdf

1、[目的]：
　　 觀察雄激素在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)過程中的積極作用，研究其促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)、抑制凋亡的分子信號途徑，初步探討雄激素替代治療保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的臨床可行性。
　　 [方法]：
　　 1.離體細(xì)胞實(shí)驗
　　 采用H2O2(100μM)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV-304細(xì)胞)18小時建立離體細(xì)胞凋亡模型，實(shí)驗組予以不同濃度二氫睪酮(0.01，0.1，1μM)預(yù)處理2小時，利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，

2、MTT方法檢測細(xì)胞活性改變，AnnexinV-FITC/PI標(biāo)記的流式細(xì)胞技術(shù)檢測凋亡細(xì)胞比例，Westernblot方法檢測Caspase-3、Caspase-9和phospho-p38MAPK表達(dá)。
　　 2.整體動物實(shí)驗
　　 應(yīng)用球囊導(dǎo)管損傷雄性去勢大兔的髂動脈內(nèi)膜，建立內(nèi)膜損傷并雄激素水平低下的整體動物模型，實(shí)驗組肌注不同濃度十一酸睪酮(3mg/kg，6mg/kg，12mg/kg)，利用光鏡和掃描電鏡觀察血管內(nèi)

3、膜和內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)情況。
　　 [結(jié)果]：
　　 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(熒光顯微鏡)
　　 ①正常對照組和二氫睪酮(1μM)對照組：細(xì)胞貼壁生長，大小比較一致，形態(tài)規(guī)則呈梭形，胞膜完整，沒有明顯凋亡跡象；
　　 ②H2O2損傷組：多數(shù)細(xì)胞體積縮小，與周圍細(xì)胞脫離，胞膜仍完整，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破壞，呈現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變；
　　 ③三組不同濃度二氫睪酮預(yù)處理組：細(xì)胞呈現(xiàn)抗凋亡跡象，高濃度二氫睪酮(

4、1μM)預(yù)處理組，細(xì)胞形態(tài)與正常對照組非常接近。
　　 2.細(xì)胞活性觀察(MTT法)
　　 正常對照組和二氫睪酮對照組細(xì)胞活性無明顯差異，H2O2損傷組細(xì)胞活性顯著下降。經(jīng)過二氫睪酮預(yù)處理，細(xì)胞活性逐漸恢復(fù)，特別是大劑量二氫睪酮預(yù)處理后，細(xì)胞活性與正常對照組無明顯差異
　　 3.流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡(AnnexinV-FITC/PI標(biāo)記)
　　 正常對照組凋亡細(xì)胞比例2.95％，二氫睪酮對照組3.92

5、%，H2O2損傷后凋亡細(xì)胞比例高達(dá)49.96%。經(jīng)過二氫睪酮預(yù)處理，凋亡細(xì)胞逐漸下降至33.54%、20.04%和6.76%，高濃度二氫睪酮預(yù)處理組凋亡細(xì)胞接近正常對照組。
　　 4.凋亡相關(guān)因子caspase-3，caspase-9和p-p38MAPK檢測(Westernblot法)
　　 H2O2損傷組，活性片段Caspase-3、Caspase-9和p-p38MAPK條帶最明顯，經(jīng)過二氫睪酮預(yù)處理的三個實(shí)驗組，條帶

6、逐漸變淡，高濃度二氫睪酮預(yù)處理組條帶亮度與正常對照組接近。
　　 5.雄激素替代治療對血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)情況(整體動物實(shí)驗)
　　 光鏡下正常對照組內(nèi)膜無明顯增生，單純球囊損傷組內(nèi)膜增生最明顯，不同濃度十一酸睪酮替代治療組，血管內(nèi)膜增生逐漸改善。掃描電鏡下正常對照組血管內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形，排列有序，大小均一；單純?nèi)萁M，內(nèi)皮細(xì)胞完全破壞，罕見完整細(xì)胞；不同濃度十一酸睪酮替代治療組，內(nèi)皮細(xì)胞排列逐漸規(guī)則，形態(tài)逐漸呈梭形，大小逐漸