基于MethyLight的骨肉瘤相關(guān)基因甲基化研究及改良全基因組DNA擴(kuò)增固定技術(shù).pdf

1、表觀遺傳現(xiàn)象足一種由非DNA序列變化引起的，并且可以遺傳的基因表達(dá)水平的變化，包括DNA甲基化，組蛋白乙?；叭旧|(zhì)的構(gòu)形改變等。DNA甲基化是影響表觀遺傳機(jī)制中的主要因素，在細(xì)胞分化、發(fā)育、增殖及凋亡過程中都起著非常重要的作用。從正常細(xì)胞變化到腫瘤是一個(gè)漫長的機(jī)理復(fù)雜的過程，涉及到多階段、多步驟、多基因作用。腫瘤細(xì)胞中基因組總體甲基化狀況異常變化，以及相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生過甲基化是腫瘤最早也是最常見的分子改變之一。DNA甲基化通常發(fā)

2、生在基因組序列中的CG位點(diǎn)密集區(qū)域，稱之為CpG島，通常為基因5’端啟動(dòng)子區(qū)和第一外顯子區(qū)。隨著分子圣物學(xué)的發(fā)展，越來越多的科研成果證明，DNA甲基化現(xiàn)象直接與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中普遍發(fā)生的癌基因活化和抑癌基因的失活相關(guān)。由此，異常的基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)的檢測(cè)可以作為腫瘤早期診斷以及傳統(tǒng)治療手段預(yù)后效果評(píng)估的一個(gè)臨床醫(yī)用分子標(biāo)記。 骨肉瘤是青少年中最常見的實(shí)體惡性腫瘤之一，每年百萬名青少年中有6人罹患此疾病。先前的很多研究表明

3、，骨肉瘤經(jīng)常發(fā)生在青少年骨骼最高速成長的時(shí)期，在相對(duì)身高偏高人群和男性中發(fā)病率較高，盡管如此，骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制至今還不是非常清楚。很多科學(xué)家預(yù)測(cè)，骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展可能和成骨細(xì)胞不正常的生長代謝調(diào)控基因有關(guān)。研究骨肉瘤相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度成為一個(gè)研究骨肉瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制和臨床預(yù)后非常有意義的工作之一。 MethyLight技術(shù)是原有MSP(甲基化特異性PCR)技術(shù)和基于Taqman探針熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。

4、可以用來高靈敏，高通量，高速度，高精度的對(duì)微量DNA樣品的甲基化狀態(tài)進(jìn)行定量分析。DNA在亞硫酸氫鹽作用下，未發(fā)生甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)C變成尿嘧啶U，而甲基化的胞嘧啶則保持不變，這就人為的形成了甲基化和非甲基化DNA片斷在序列上的差異。然后在一對(duì)位點(diǎn)特異的引物之間設(shè)計(jì)一個(gè)可與待測(cè)位點(diǎn)互補(bǔ)的探針，探針的5’端和3’端分別用報(bào)告熒光(如FAM)和淬滅熒光(如TAMRA)標(biāo)記。如果探針可與待測(cè)位點(diǎn)雜交，那么在PCR延伸期間，Taq聚合酶5’到3’

5、端的外切核酸酶活性會(huì)將探針5’端的報(bào)告基團(tuán)切下，淬滅基團(tuán)對(duì)其的抑制作用將消失，通過測(cè)定報(bào)告基團(tuán)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可判斷出DNA的甲基化狀態(tài)。這個(gè)方法同時(shí)具有MSP的特異性和靈敏性以及熒光定量PCR的快速和抗污染等特性，可對(duì)微量臨床樣本的甲基化進(jìn)行定量檢測(cè)。本文在30例骨肉瘤樣本及相對(duì)應(yīng)的正常樣本中，選取了11個(gè)與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因包括抑癌基因CDKN2A、APC、．RASSFIM、ESRI、RARβ-2；DNA修復(fù)基因MGMT、TER

6、T；腫瘤分子侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因DAPK，TIMP3、THBS1；以及代謝酶基因MTHFR，對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了基于上述MethyLight技術(shù)的相對(duì)定量甲基化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這11種基因中的10種和正常組織相比都發(fā)生了明顯的甲基化水平升高的現(xiàn)象。而將其甲基化水平累加后再次分析腫瘤組織和正常組織之間的甲基化水平差異，可以得到更加明顯的結(jié)果，同時(shí)，在發(fā)生轉(zhuǎn)移和不發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者樣本中，在不同性別的患者樣本中，我們也觀察到了明顯的甲基化水平差異。

7、 在上述實(shí)驗(yàn)過程中，我們也發(fā)現(xiàn)了一系列的問題，隨著基因芯片技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)等高通量高速度檢測(cè)方法的運(yùn)用，同時(shí)平行檢測(cè)大量樣本的同時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)中所需要DNA樣本的數(shù)量提出了更高的要求這也成為了這些新技術(shù)廣泛應(yīng)用的障礙和瓶頸。同時(shí)來自于臨床微創(chuàng)采樣技術(shù)和法醫(yī)采樣的樣本通常數(shù)量很少，采集和提取出的DNA含量難以滿足現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)的要求。本文率先提出了一個(gè)新的DNA樣本擴(kuò)增保存重復(fù)利用的技術(shù)。我們用生物素標(biāo)記的6N隨機(jī)引物(5’

8、-biotin-NNNNNN-3’)利用Phi29DNA聚合酶高效率，高保真線性擴(kuò)增的特點(diǎn)，對(duì)基因組進(jìn)行線性擴(kuò)增，得到5’端生物素標(biāo)記的單鏈DNA片斷。然后利用生物素和親和素緊密穩(wěn)定連接作用的特性使單鏈DNA片斷結(jié)合在親和素包被的磁珠上，可以在下游實(shí)驗(yàn)中(例如PCR實(shí)驗(yàn)等)重復(fù)多次利用。這種方法僅需要傳統(tǒng)全基因組擴(kuò)增方法所需時(shí)間的六分之一到三分之一，Phi29DNA聚合酶的高保真擴(kuò)增特性還可以保證擴(kuò)增片斷和原始片斷的高度一致，擴(kuò)增片斷的