多巴胺受體對(duì)神經(jīng)肽Y受體介導(dǎo)的促血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移的影響及機(jī)制.pdf

1、一、研究背景
　　動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)病和多發(fā)病，隨著對(duì)AS研究的深入，人們對(duì)AS的認(rèn)識(shí)有了巨大的進(jìn)步，但AS病因仍不明了，因此明確AS的發(fā)生機(jī)理對(duì)于AS的防治具有重要的意義。目前，AS的發(fā)病機(jī)制存在多種學(xué)說(shuō)，如脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、脂蛋白氧化應(yīng)激修飾損傷學(xué)說(shuō)、炎癥學(xué)說(shuō)、致突變學(xué)說(shuō)、血栓形成學(xué)說(shuō)、內(nèi)皮細(xì)胞損傷學(xué)說(shuō)、平滑肌細(xì)胞克隆學(xué)說(shuō)等，但AS的具體機(jī)制尚未完全闡明。平滑肌細(xì)胞克隆學(xué)說(shuō)

2、與AS的關(guān)系已被證實(shí)，血管平滑肌細(xì)胞（Vascular smooth muscle cells， VSMCs）異常增殖、VSMCs遷移至內(nèi)膜，形成AS斑塊，導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄、血管順應(yīng)性降低，VSMCs生物學(xué)功能的改變?cè)谠l(fā)性高血壓（Essential Hypertension，EH）、AS和血管成形術(shù)后管腔再狹窄等血管平滑肌增殖性疾病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。
　　交感神經(jīng)系統(tǒng)在心血管系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)得到公認(rèn),神經(jīng)

3、肽 Y(Neuropeptide Y,NPY)做為交感神經(jīng)分泌的主要神經(jīng)遞質(zhì)之一,是1982年從豬腦組織中發(fā)現(xiàn)并分離提純出來(lái)，由36個(gè)氨基酸組成的多肽，屬于胰多肽家族。NPY廣泛分布于哺乳動(dòng)物的中樞及外周交感神經(jīng)系統(tǒng)，在血壓調(diào)節(jié)、血管的狹窄及AS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。NPY不僅對(duì)血管產(chǎn)生直接的縮血管作用，還能加強(qiáng)腎上腺素、去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)和內(nèi)皮素等縮血管物質(zhì)對(duì)血管的收縮作用，使血壓進(jìn)一步升高。

4、在高血壓狀態(tài)下，無(wú)論是高血壓病人還是自發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneously hypertensive rat， SHR）模型，血漿中的NPY濃度明顯升高。而且在高血壓狀態(tài)下，NPY受體的親和力增加。已有研究發(fā)現(xiàn)，NPY對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、VSMCs有強(qiáng)烈的促增殖、促遷移作用，加劇AS病變發(fā)展過(guò)程。交感神經(jīng)系統(tǒng)中還存在另一重要的神經(jīng)遞質(zhì)—多巴胺。多巴胺受體屬于視紫紅質(zhì)類家族。多巴胺系統(tǒng)在心血管系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用已得到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。小劑量

5、的多巴胺可以通過(guò)作用多巴胺D1受體發(fā)揮舒血管作用。在腎臟及動(dòng)脈系統(tǒng)均有表達(dá)，起著舒張血管、利鈉排尿的作用。在我們以前的實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)了在高血壓狀態(tài)下，多巴胺受體的功能受損，多巴胺受體介導(dǎo)腎臟排鈉利尿作用降低，血容量增多，血壓升高。敲除多巴胺受體，引起基因敲除小鼠血壓的明顯升高。多巴胺受體本身對(duì)VSMCs的增殖并無(wú)影響，但多巴胺D1類、D3受體的激活對(duì)NE、胰島素介導(dǎo)的促VSMCs增殖作用具有明顯的抑制作用。近年的諸多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，激活多巴

6、胺D1類，能抑制血小板源性生長(zhǎng)因子（Platelet-Derived Growth Factor,PDGF)-BB介導(dǎo)的促VSMCs遷移、增殖作用。因此，多巴胺及其受體有可能通過(guò)拮抗?-腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)及交感神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮直接、間接抗AS病變形成的作用。
　　NPY與NE同屬交感神經(jīng)遞質(zhì)，在某些疾病或應(yīng)激狀態(tài)下，二者與多巴胺的神經(jīng)遞質(zhì)囊泡在外周神經(jīng)系統(tǒng)同時(shí)釋放，所以，我們推測(cè)NPY與多巴胺之間的相互作用有可能參與了AS的發(fā)生、發(fā)展

7、。
　　二、研究目的
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察SD（Sprague-Dawley Rats）大鼠原代VSMCs在多巴胺D1類受體或多巴胺D3類受體與NPY受體共同激活共同的情況下，觀察VSMCs增殖、遷移作用的變化，了解多巴胺與NPY在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的相互作用。
　　三、研究?jī)?nèi)容
　　1．SD大鼠原代VSMCs培養(yǎng)的分離、培養(yǎng)。證實(shí)NPY對(duì)SD大鼠原代VSMCs的促增殖作用，以及NPY對(duì)SD大鼠原代VSMCs的促增

8、殖作用是通過(guò)NPY哪個(gè)亞型受體發(fā)揮作用。
　　2．用不同濃度的多巴胺D-1類受體激動(dòng)劑fenoldopam作用于VSMCs，觀察fenoldopam對(duì)VSMCs本身有無(wú)增殖作用。
　　3．觀察NPY與fenoldopam同時(shí)存在的情況下，VSMCs的增殖作用有無(wú)發(fā)生改變，如果VSMCs的增殖作用發(fā)生改變，那么多巴胺D-1類受體的激活通過(guò)何種機(jī)制對(duì)NPY促VSMCs細(xì)胞的增殖發(fā)生影響。
　　4．觀察NPY對(duì)SD大鼠原代V

9、SMCs是否有促遷移作用，以及NPY對(duì)SD大鼠原代VSMCs的促遷移作用是通過(guò)NPY哪個(gè)亞型受體發(fā)揮作用。
　　5．用不同濃度的多巴胺D-3類受體激動(dòng)劑PD128907作用于VSMCs，觀察PD128907對(duì)VSMCs本身有無(wú)遷移作用。如果VSMCs的遷移作用發(fā)生改變，那么多巴胺D-3類受體的激活通過(guò)何種機(jī)制對(duì)NPY促VSMCs細(xì)胞的遷移發(fā)生影響？
　　四、研究方法
　　1．SD大鼠原代VSMCs培養(yǎng)的培養(yǎng)采用血管組織

10、法培養(yǎng)。SD大鼠原代VSMCs的鑒定采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法及細(xì)胞免疫組織化學(xué)方法。
　　2．細(xì)胞增殖檢測(cè)的方法采用[H3]-TdR、MTT、細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。
　　3．細(xì)胞遷移檢測(cè)的方法采用細(xì)胞遷移Transwell實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)方法。?
　　五、研究結(jié)果
　　1．經(jīng)培養(yǎng)出來(lái)的原代VSMCs,在倒置顯微鏡下觀察：細(xì)胞彼此融合,細(xì)胞密集呈束狀放射狀排列,形成典型的―峰-谷‖樣生長(zhǎng)特征。經(jīng)純化后，第4代VSMCs用抗

11、SM- actin抗體，經(jīng)細(xì)胞免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)鑒定為VSMCs。
　　2．NPY呈濃度依賴性對(duì) SD大鼠原代 VSMCs有明顯的促增殖作用，此增殖作用被NPY Y1亞型受體抑制劑BIBP3226所阻斷。
　　3．多巴胺 D-1類受體激動(dòng)劑 fenoldopam本身對(duì) VSMCs增殖作用并無(wú)影響。但在fenoldopam與NPY同時(shí)存在的情況下，NPY對(duì)VSMCs的增殖作用則被抑制。蛋白激酶A（Protein kinase

12、 A，PKA）抑制劑阻斷了fenoldopam對(duì)NPY促VSMCs的增殖作用。
　　4．NPY呈濃度依賴性對(duì) SD大鼠原代 VSMCs有明顯的促遷移作用，此遷移作用被NPY Y1亞型受體抑制劑BIBP3226所阻斷。
　　5．多巴胺 D-3類受體激動(dòng)劑 PD128907本身對(duì) VSMCs的遷移作用并無(wú)影響，但在PD128907與NPY同時(shí)存在的情況下，NPY對(duì)VSMCs的遷移作用則被抑制。PKA抑制劑阻斷了PD128907對(duì)