莜麥病程相關(guān)蛋白Permatin抗真菌機(jī)理的初步分析.pdf

1、植物在受到病原菌侵染或者一些非生物脅迫時(shí)會(huì)大量分泌一種參與協(xié)同防御的蛋白，即病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis related proteins，PRPs)。PRPs廣泛分布于多種植物中。根據(jù)其氨基酸序列和血清學(xué)關(guān)系等， PRPs被分為17個(gè)亞類（PR1-PR17）。病程相關(guān)蛋白第5家族，即 P R-5類蛋白，是一類與甜味蛋白（Thaumatin）高度同源的類甜蛋白，具有抗真菌、β-1,3-葡聚糖酶、淀粉酶抑制劑等多種活性。目前已從

2、植物、節(jié)肢動(dòng)物、甚至真菌中發(fā)現(xiàn)了100多種P R-5類蛋白。實(shí)驗(yàn)室前期從莜麥種子中分離得到的一種具有抗真菌活性的蛋白Permatin， Permatin的分子量大小為23 kDa，經(jīng)質(zhì)譜鑒定屬于PRPs的第五家族蛋白（PR-5類）。Permatin蛋白可以抑制毛殼菌、木霉、白腐菌的生長(zhǎng)，具有明顯的抗真菌活性。
　　本文對(duì)Permatin蛋白的抗真菌機(jī)理進(jìn)行了初步的分析。首先利用固體平板帶毒濾紙片法和形態(tài)觀察法分別分析了 Perma

3、tin蛋白對(duì)鐮刀菌、青霉及酵母等的生長(zhǎng)抑制性。利用膜染料FM1-43染色和DAPI染色，在Delta vision熒光顯微鏡下觀察了 Permatin蛋白對(duì)鐮刀菌和酵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響，結(jié)果顯示 Permatin蛋白可以引起鐮刀菌菌絲體和酵母細(xì)胞的膜壁裂解破碎，內(nèi)容物外滲等異常形態(tài)變化。其次將去掉信號(hào)肽的 permatin（22-225aa）基因片段克隆到 pET-32L-3C載體上并在進(jìn)行了大腸桿菌上進(jìn)行了重組表達(dá)及純化。利用甲醇-氯仿

4、法萃取了鐮刀菌的膜脂，通過(guò)熒光光譜技術(shù)和圓二色對(duì) Permatin和真菌膜脂的結(jié)合能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，并用PIP StripsTM脂質(zhì)膜免疫印跡檢測(cè)與Permatin相互作用的膜脂成分。結(jié)果表明，Permatin與真菌膜脂具有相互作用，且主要與膜脂中的磷脂酰肌醇相互作用。最后利用熒光探針DCFH-DA在熒光顯微鏡和熒光分光光度計(jì)下檢測(cè)了 Permatin蛋白對(duì)鐮刀菌和釀酒酵母細(xì)胞的活性氧含量影響，結(jié)果顯示Permatin可以引起真菌體內(nèi)的活性