莜麥病程相關(guān)蛋白Permatin抗真菌機理的初步分析.pdf

1、植物在受到病原菌侵染或者一些非生物脅迫時會大量分泌一種參與協(xié)同防御的蛋白，即病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis related proteins，PRPs)。PRPs廣泛分布于多種植物中。根據(jù)其氨基酸序列和血清學(xué)關(guān)系等， PRPs被分為17個亞類（PR1-PR17）。病程相關(guān)蛋白第5家族，即 P R-5類蛋白，是一類與甜味蛋白（Thaumatin）高度同源的類甜蛋白，具有抗真菌、β-1,3-葡聚糖酶、淀粉酶抑制劑等多種活性。目前已從

2、植物、節(jié)肢動物、甚至真菌中發(fā)現(xiàn)了100多種P R-5類蛋白。實驗室前期從莜麥種子中分離得到的一種具有抗真菌活性的蛋白Permatin， Permatin的分子量大小為23 kDa，經(jīng)質(zhì)譜鑒定屬于PRPs的第五家族蛋白（PR-5類）。Permatin蛋白可以抑制毛殼菌、木霉、白腐菌的生長，具有明顯的抗真菌活性。
　　本文對Permatin蛋白的抗真菌機理進行了初步的分析。首先利用固體平板帶毒濾紙片法和形態(tài)觀察法分別分析了 Perma

3、tin蛋白對鐮刀菌、青霉及酵母等的生長抑制性。利用膜染料FM1-43染色和DAPI染色，在Delta vision熒光顯微鏡下觀察了 Permatin蛋白對鐮刀菌和酵母細胞形態(tài)學(xué)影響，結(jié)果顯示 Permatin蛋白可以引起鐮刀菌菌絲體和酵母細胞的膜壁裂解破碎，內(nèi)容物外滲等異常形態(tài)變化。其次將去掉信號肽的 permatin（22-225aa）基因片段克隆到 pET-32L-3C載體上并在進行了大腸桿菌上進行了重組表達及純化。利用甲醇-氯仿

4、法萃取了鐮刀菌的膜脂，通過熒光光譜技術(shù)和圓二色對 Permatin和真菌膜脂的結(jié)合能力進行評價，并用PIP StripsTM脂質(zhì)膜免疫印跡檢測與Permatin相互作用的膜脂成分。結(jié)果表明，Permatin與真菌膜脂具有相互作用，且主要與膜脂中的磷脂酰肌醇相互作用。最后利用熒光探針DCFH-DA在熒光顯微鏡和熒光分光光度計下檢測了 Permatin蛋白對鐮刀菌和釀酒酵母細胞的活性氧含量影響，結(jié)果顯示Permatin可以引起真菌體內(nèi)的活性