丙型肝炎病毒5’非編碼區(qū)及非結(jié)構(gòu)蛋白5A的基因變異及其其臨床意義.pdf

1、研究背景和目的：丙型肝炎(Hepatitis C)是威脅人類身體健康的重要傳染病，其病原體是丙型肝炎病毒(HCV)，全球范圍內(nèi)大約有1.7億人感染了HCV，我國的感染率約為3％。HCV感染容易慢性化，慢性丙型肝炎約有20％～30％會在20年內(nèi)緩慢進(jìn)展為肝硬化和肝癌，HCV感染成為導(dǎo)致肝癌及終末期肝病的重要原因。HCV為單股正鏈RNA病毒，整個基因組只有一個開放讀碼框(ORF)，位于基因組中央，在基因組的5’和3’末端各含有一段非編碼序列

2、(NCR)?；蚪M從5'NCR依次為C、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B及3'NCR，C區(qū)編碼核殼蛋白，E1、E2區(qū)編碼包膜糖蛋白，P7及NS2到NS5分別編碼不同功能的非結(jié)構(gòu)蛋白。HCV具有高度變異性，但不同區(qū)段變異率不同，有些區(qū)段變異性較大，而另有些區(qū)段則遺傳保守性很高，其中5'NCR和C區(qū)最保守，E區(qū)最容易變異。HCV5'NCR是整個基因組最為保守的區(qū)域，長度和序列非常穩(wěn)定，這個區(qū)段核苷酸突

3、變少，并且其變異可以代表基因型。HCV可以分為6個基因型及不同亞型，HCV基因型分布有明顯的地域差別，我國大陸主要是1b、2a型及少量的1a、2b、3b、4a及6a型等。研究表明，HCV基因型與臨床有密切的關(guān)系，基因1型HCV感染者往往病毒載量較高，疾病進(jìn)展快，對干擾素的應(yīng)答較差，但是基因型對臨床的影響仍然存在一定的爭議。HCV5'NCR是病毒復(fù)制的起始部分，在病毒的復(fù)制及病毒蛋白的翻譯方面起到很重要的作用，5'NCR某些核苷酸的特異性

4、變異可能會影響病毒的復(fù)制水平及對干擾素的治療應(yīng)答。NS5A是HCV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，在HCV多蛋白的成熟和RNA的復(fù)制過程中具有十分重要的作用，具有抗肝細(xì)胞凋亡作用，并下調(diào)干擾素α(IFNα)刺激的抗病毒效應(yīng)。HCVNS5A某些區(qū)域的基因變異可能導(dǎo)致其抗干擾素作用的減弱，研究最多的區(qū)域是ISDR，日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)NS5A羧基末端第2209到2248氨基酸的40個氨基酸區(qū)域的序列與干擾素治療的敏感性有關(guān)，將這個區(qū)域稱為干擾素敏感決定區(qū)(I

5、SDR)，認(rèn)為ISDR變異株(4個以上氨基酸突變)對干擾素的應(yīng)答較好，但是歐洲和美國的一些研究并未證實(shí)ISDR的突變與治療轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，考慮ISDR外還存在與干擾素療效相關(guān)的序列，如V3區(qū)、干擾素及利巴韋林耐藥區(qū)(IRRDR)等。目前對ISDR變異與干擾素應(yīng)答關(guān)系的研究較多，但是對NS5A區(qū)基因全序列的變異對干擾素應(yīng)答影響的研究還很少，國內(nèi)尚未見報道。
　　 為了明確HCV5'NCR及NSSA的變異情況以及變異對臨床的影響，本研究

6、應(yīng)用基因芯片法及基因測序法檢測山東地區(qū)HCV感染者5'NCR區(qū)，對進(jìn)行抗病毒治療的基因1b型慢性丙型肝炎病人進(jìn)行NS5A序列測定，觀察HCV5'NCR及NS5A的變異情況及其臨床意義。
　　 材料與方法：
　　 1.2005年1月至2008年10月期間濟(jì)南市傳染病醫(yī)院門診及住院的慢性丙型肝炎及肝硬化病人170例，抗HCV及HCV RNA均陽性，并排除了HAV、HBV、HEV、HIV感染及酒精性肝炎和藥物性肝炎，空腹抽靜脈

7、血5ml。應(yīng)用聚乙二醇干擾素α-2a180ug或α-2b1.0-1.5ug/kg治療，基因1型療程12個月聯(lián)合利巴韋林800-1200mg，非基因1型療程6個月聯(lián)合利巴韋林800-1000mg。應(yīng)用基因芯片法檢測HCV基因型，觀察基因型與疾病嚴(yán)重程度、感染途徑、HCV RNA定量及干擾素應(yīng)答的關(guān)系。
　　 2.2008年1月至2009年12月期間濟(jì)南市傳染病醫(yī)院住院的慢性丙型肝炎病人118例，進(jìn)行HCV5'NCR.的序列測定，應(yīng)

8、用分子生物學(xué)軟件ClustalX2.0及Mega4.0進(jìn)行分析，以Mega4.0軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，以此了解不同病毒株的親源性；與國內(nèi)外HCV流行株相比較，觀察不同病毒株5'NCR區(qū)核苷酸序列的變異，了解山東地區(qū)HCV5'NCR的基因變異特點(diǎn)；觀察特征性的基因變異與HCVRNA定量水平及干擾素應(yīng)答的關(guān)系。
　　 3.對35例進(jìn)行抗病毒治療的基因1b型慢性丙型肝炎病人治療前的血清進(jìn)行NS5A序列測定，全長NS5A序列設(shè)計5對引物，

9、分5段進(jìn)行測序，測序結(jié)果應(yīng)用ClustalX2.0及Mega4.0軟件進(jìn)行核苷酸及氨基酸序列的比對，與HCV1b型標(biāo)準(zhǔn)株HCV-J比較，觀察NS5A全基因的核苷酸及氨基酸變異率及特異性的區(qū)域ISDR、V3區(qū)、IRRDR等的變異情況，以及以上變異與干擾素應(yīng)答的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.基因芯片法檢測HCV基因型結(jié)果為：基因1b型63.1％，2a型28.6％，1a及3b型均為1.19％，1b+2a及1a+1b混合型6％

10、；肝硬化和慢性肝炎兩組病人基因型分布無差別；有輸血史者占67.9％，有輸血史者及無輸血史者基因型分布無差別；基因1b型與基因2a型血清HCV RNA定量log值分別為：6.42±1.0及5.69±1.15，t=3.89，p=0.0001；基因1b型與基因2a型抗病毒治療SVR率分別為63.6％、90％，0.01　　 2.慢性丙型肝炎病人的5'NCR.區(qū)基因序列分析結(jié)果表明：基因型分別為1b型65例、基因2a型4

11、5例、1a型2例、3a型1例、3b型2例及6a型3例。
　　 3.42例1b型慢性丙型肝炎病人5'NCR區(qū)序列跟國內(nèi)外多數(shù)參考株序列相同，23例病人發(fā)生1-2堿基變異，存在120位C-T(9例)和204位C-T(8例)兩個位點(diǎn)的特征性變異。2例1a病人5'NCR區(qū)基因序列與中國株序列相同，與2株美國株同源性為99.5％-100％。2a型病人5’NCR序列同源性為97.8％-100％，存在與參考株完全相同的病毒株，共有11個位點(diǎn)存

12、在堿基變異，有222位及247位兩個位點(diǎn)的特征性變異，根據(jù)這兩個位點(diǎn)堿基的不同可以將2a型病人分為3組：均為T組、均為C組及分別為C、T組。3a型5'NCR和標(biāo)準(zhǔn)株同源性為98.1％，有4個堿基不同。2例3b型病人的5'NCR與國內(nèi)外流行株同源性分別為99.1％-100％。6a病人都具有特征性的第-145位的CA插入，病人及參考株之間僅存在3個位點(diǎn)的堿基的不同，其中2例病人序列與中國株之一相同，與另一中國株及香港株同源性均為99.5％，

13、另外1例病人與參考株的同源性為98％-99.5％。
　　 4.1b型5'NCR區(qū)120位C-T變異株和野毒株HCV RNA定量分別為5.16±1.40 log和6.14±1.01 log(p=0.041)，差別有顯著性；而1b型5'NCR區(qū)204位C-T變異株和野毒株HCV RNA定量分別為5.95±0.95 log和6.14±1.01 log(p=0.23)。2a型病人根據(jù)5'NCR.第222位及247位的堿基分為3組，3組病

14、人HCV RNA定量沒有明顯差別。1b型及2a型5'NCR區(qū)變異株與野毒株比較干擾素的應(yīng)答率沒有差異。
　　 5.35例病人中有20例得到全序列HCV NS5A測序結(jié)果，其中11例實(shí)現(xiàn)持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)，9個病人無應(yīng)答或停藥后復(fù)發(fā)(NR)。與HCV標(biāo)準(zhǔn)株J株進(jìn)行比較，NS5A變異率較高，核苷酸變異數(shù)目為136±9.2，氨基酸變異數(shù)目為31.3±4.2，但病人之間同源性較高。SVR及NR兩組病人NS5A全長序列的氨基酸變異數(shù)

15、目沒有差別(32.4±4.4及30.4±3.7，p=0.302)，ISDR為突變型、中間型及野生型人數(shù)分別為：1、6、2及0、4、7(p>0.05)，IRRDR氨基酸變異數(shù)目在SVR組及NR組分別為：6±1.33及4.4±1.14(p=0.014)，SVR組及NR組氨基酸變異數(shù)≥6的比例分別為6/9及2/11(p=0.04)，差異有顯著性。
　　 結(jié)論：
　　 1.山東地區(qū)HCV主要流行株是基因1b型，其次為2a型，存在

16、少量的1a、3a、3b、6a型及混合型感染。其中基因3a和6a型感染以前在山東地區(qū)未見報道。
　　 2.HCV感染者大部分有輸血史，基因型與疾病的進(jìn)展無關(guān)，1b型感染者HCVRNA定量(病毒載量)較高，且持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答較差。
　　 3.HCV5NCR區(qū)序列高度保守，與國內(nèi)外流行株同源性高，變異率低?；?b型及2a型5'NCR區(qū)均有特征性的核苷酸變異，1b型HCV感染者5'NCR第120位C-T的變異減弱了病毒的復(fù)制水平