丙型肝炎病毒5’端非編碼區(qū)的不同結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浞g啟動(dòng)活性的影響.pdf

1、目的丙型肝炎病毒(HCV)感染是慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌的主要原因，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。HCV 5'端非編碼區(qū)(5'NCR)含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，以非帽依賴機(jī)制介導(dǎo)著-HCV基因翻譯，且堿基序列高度保守，因此HCV 5'NCR是抗HCV藥物篩選的主要靶位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建一系列含有HCV 5'NCR 5'端梯度缺失序列調(diào)控螢火蟲熒光素酶(luc)報(bào)告基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，以分析影響HCV 5'NCR的翻譯啟動(dòng)活性的功

2、能序列，為進(jìn)一步研究HCV IRES的結(jié)構(gòu)與功能提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。 方法以pCMVNCRluc(以下簡稱pCNI)為模板，PCR 擴(kuò)增獲得一系列HCV 5'NCR 5’端梯度缺失序列，然后利用基因重組技術(shù)，用這些序列分別替換pCNI中的完整HCV 5'NCR，構(gòu)建HCV 5'NCR5，端梯度缺失序列調(diào)控luc的真核表達(dá)質(zhì)粒pCNl-d1、pCNl-d2、pCNl-d3、pCNI-d4；同時(shí)。PCR擴(kuò)增缺失所有HCV序列的模板

3、片段，構(gòu)建無HCV 5'NCR片段的luc真核表達(dá)質(zhì)粒pCNI-d5；各重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和DNA測序鑒定；用脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將上述重組質(zhì)粒及pCNl轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞株HepG2；轉(zhuǎn)染后48h用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶相對活性以分析5'NCR 5'端梯度缺失序列對luc基因的調(diào)控作用，并經(jīng)RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中l(wèi)uc基因的相對表達(dá)水平觀察luc基因在轉(zhuǎn)錄水平有無不同。 結(jié)果PCR擴(kuò)增分別獲得5'端缺失ntl

4、-20,ntl-43,ntl-118和ntl-330的HCV 5'NCR片段，及缺失所有HCV序列的模板片段；經(jīng)酶切和測序鑒定表明HCV 5'NCR 5'端梯度缺失序列調(diào)控luc的真核表達(dá)質(zhì)粒pCNl-dl、pCNl-d2、pCNI-d3、pCNl-d4和無HCV 5'NCR片段的luc真核表達(dá)質(zhì)粒pCNl-d5構(gòu)建成功；各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后luc mRNA的相對表達(dá)水平與pCNl相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)：pCNl-d1、p

5、CNl-d2表達(dá)的熒光素酶活性與pCNl差異無顯著性(P>0.05)，pCNl-d3與pCNl-d4的熒光素酶活性與空白對照差異無顯著性(P>0.05)，pCNl-d5的熒光素酶相對表達(dá)活性為pCNl的70％。 結(jié)論 成功構(gòu)建了由HCV 5'NCR 5’端梯度缺失序列調(diào)控luc表達(dá)的質(zhì)粒pCNl-dl、pCNl-d2、pCNl-d3、pCNl-d4和無HCV 5'NCR片段的luc真核表達(dá)質(zhì)粒pCNl-d5；在本實(shí)驗(yàn)條件下，HC