胸腔積液中腫瘤細胞血管管型生成結(jié)構(gòu)的觀察與研究.pdf

1、前言：
　　 腫瘤是典型的血管依賴性病變,其必須建立自己的血管網(wǎng)絡(luò)從而打破宿主內(nèi)在微環(huán)境的平衡進行生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。血管生成擬態(tài)(vasculogeniemimicry,VM)的提出豐富了腫瘤血管生成理論,其特點是在人眼葡萄膜黑色素瘤中可以看到無內(nèi)皮細胞的管道,管道內(nèi)壁沒有血管內(nèi)皮細胞襯覆,腫瘤細胞模仿機體血管生成在管壁外表面排列取代內(nèi)皮細胞構(gòu)成血供通道,管道內(nèi)可見流動的紅細胞。我們在細胞病理學(xué)中發(fā)現(xiàn)肺源性非小細胞肺癌(NSCL

2、)患者胸腔積液離體后進行石蠟包埋切片后腫瘤細胞之間互相連接形成中空管腔樣結(jié)構(gòu),我們將這樣的結(jié)構(gòu)成為“腫瘤細胞血管樣管型”,并推斷NSCLC胸腔積液在缺少細胞外基質(zhì)支持和缺氧的條件下腫瘤細胞為了自身的生存,便于營養(yǎng)物質(zhì)的交換、代謝甚至是再轉(zhuǎn)移也可以分化成腫瘤細胞血管管型的形態(tài)擔(dān)當(dāng)起血管和淋巴管的功能,對離體的腫瘤細胞提供營養(yǎng)和氧氣。
　　 目的：
　　 探討腫瘤細胞血管管型與組織及細胞系中VM之間的區(qū)別和聯(lián)系。證明腫瘤細胞

3、血管管型結(jié)構(gòu)是否具有血管及淋巴管內(nèi)皮標記物的表達,并將觀察到的管腔結(jié)構(gòu)進行形態(tài)分類。建立裸鼠腫瘤模型,在組織學(xué)水平進一步證實腫瘤細胞血管管型的存在。
　　 材料與方法：
　　 1、材料
　　 收集2010年1月至2011年12月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診及病房胸腔積液,優(yōu)選以腫瘤細胞為主、炎性細胞較少(腫瘤細胞約占整張切片的95%以上)未接受過治療的100例NSCLC胸腔積液作為研究對象(經(jīng)臨床表現(xiàn)、CT、MR

4、等臨床資料及41.5%的患者進一步做肺部腫瘤進行肺穿后進組織病理學(xué)診斷為NSCLC,另外100例良性胸腔積液標本作為對照。這50人中男性為104人,女性為96人,年齡從30歲至82歲,平均年齡均為61歲。
　　 2、液基細胞薄層檢測技術(shù)(TCT):
　　 收集新鮮胸水20ml左右,室溫下800r/min離心5分鐘,棄去上清,取沉淀底層細胞,加入清洗液后再次離心。取沉淀與保存液混合后機器Thinprep2000自動制片。<

5、br>　　 3、免疫細胞化學(xué)染色
　　 CD31(SC-71872)、CD105(SC-2048)、CD34(SC-65261)、D2-40(SC-50415)、LYVE-1(SC-31290)、TTF-1(SC-53136)、CK5&6(SC-60041)、CK7(SC-35155)均購自美國SantaCruz公司,CDl33(130-094-913)購自德國美天旎公司。采用鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶(streptavidi

6、n-peroxidase,SP)法,PBS緩沖液代替第一抗體作為空白對照,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。常規(guī)脫水透明,中性樹膠封片。
　　 4、免疫熒光染色方法
　　 免疫熒光雙染法法檢測CD31、CD34、CDl05、D2-40、LYVE-1的表達定位。將選出的切片放于69℃烤片機上2小時,后二甲苯中脫蠟,酒精脫苯,高溫高壓法進行抗原修復(fù)。非免疫動物血清37℃封閉30分鐘,滴加一抗(1:100稀釋,選擇不同二抗的一抗按1:1

7、比例兩兩混合),4"孵育過夜;免疫熒光二抗(1:500稀釋,不同種屬二抗按1:1兩兩混合),,37"C孵育30分鐘。DAPI復(fù)染細胞核。50%緩沖甘油封片,熒光顯微鏡Nikon90i下觀察并照相。孵育二抗以后步驟均在避光條件下進行。陰性對照實驗:用等量的0.01mol/LPBS代替一抗,其余步驟同前。結(jié)果判定:以細胞胞漿中呈現(xiàn)明亮的綠色和紅色熒光信號,合成后為黃色的熒光信號定位為陽性。
　　 5、WestemBlot蛋白印跡

8、r>　　 檢測血管及淋巴管上皮因子的表達水平。在70例NSCLC患者胸腔積液,30例炎性及增生胸腔積液中檢測CD31、CD34、CDl05、LYVE-1的蛋白水平。蛋白從胸腔積液細胞中提取,冰上超聲處理,4℃靜置,孵育50min,4℃離心20min(800r/min),提取上清,放入-70℃冰箱里保存。使用前用Brodford法測定蛋白濃度,每孔80μg蛋白加入10%SDS-PAGE凝膠電泳后,40V(LYVE-1)、80V(CD31

9、、CD34、CD105)條件下濕電轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)入0.22μmPVDF膜,5%脫脂奶粉封閉液封閉2h,一抗(1:100稀釋)4℃過夜,后用TTBS沈膜,二抗(1:1000稀釋),X底片曝光,顯影,定影后拍照,以β-actin為內(nèi)參,用凝膠成像及分析系統(tǒng)(BiolmagingSystems,美國)分析蛋白各條帶的灰度值,每組結(jié)果均為相同條件重復(fù)3次。Westernblotting試驗中使用的試劑包括:CD31(SC-71872)、CDl0

10、5(SC-2048)、CD34(SC-65261)、LYVE-1(SC-31290)均購自美國SantaCruz公司。
　　 6、裸鼠NSCLC胸腔積液移植腫瘤動物模型
　　 雌性BALB/C裸鼠24只,4～6周齡,體重18～24g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司,裸鼠在恒溫18～22℃、恒定濕度(50～80%)的SPF層流罩中飼養(yǎng),自由攝入無菌的標準飼料和無菌水,合格證編號2007000519646。將診斷為非小細胞肺

11、癌患者胸腔積液中腫瘤細胞進行細胞計數(shù)后移植到裸鼠背部皮下,并于1天、3天、7天、14天解剖取出腫瘤包塊進行HE染色及免疫組織化學(xué)染色。
　　 7、肺源性非小細胞肺癌患者肺穿后固定包埋,HE染色
　　 8、統(tǒng)計分析
　　 各組資料利用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析。P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 NSCLC患者胸腔積液TCT中均發(fā)現(xiàn)緊密彩球狀、鱗片狀或是燈泡狀聚集的腫瘤細胞,對陽性標本

12、包埋、切片HE染色后可觀察到單個、兩個甚至多個腫瘤細胞組成的血管樣管型結(jié)構(gòu),并將發(fā)現(xiàn)的血管樣結(jié)構(gòu)歸納為13種形態(tài)結(jié)構(gòu);血管、淋巴管內(nèi)皮因子的免疫細胞化學(xué)染色、免疫熒光染色、Western-blot結(jié)果均為陽性表達;裸鼠腫瘤細胞移植模型在建立的第7天的腫瘤包塊可見大量的腫瘤細胞血管管型,并在管型中發(fā)現(xiàn)大量紅細胞;將NSCLC患者的肺部腫物組織HE染色也發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞圍成的血管樣結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)論：
　　 細胞病理學(xué)和組織病理