內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與糖尿病心肌病心肌細(xì)胞凋亡關(guān)系的實(shí)驗(yàn) 研究背景：有關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制中的作用國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，明確兩者關(guān)系，在糖尿病心肌病的防治中將起到重要作用。 目的： 1.構(gòu)建DCM動(dòng)物模型。 2.探討DCM動(dòng)物模型心臟重構(gòu)及心功能改變情況。 3.明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子在DCM大鼠心肌內(nèi)表達(dá)情況。 方法： 1.DCM動(dòng)物模型構(gòu)建雄性Wistar大鼠30只，隨

2、機(jī)分為2組：對(duì)照組10只，DCM組20只。標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)1周后，禁食12h，DCM組大鼠給以腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(STZ)65mg/kg，對(duì)照組大鼠注射等量檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖液。糖尿病大鼠成模的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：連續(xù)2次空腹血糖≥16.7mmol/L。未達(dá)成模標(biāo)準(zhǔn)者剔除。DCM組大鼠血糖升高后，繼續(xù)喂養(yǎng)5個(gè)月，處死取材。 2.超聲心動(dòng)圖檢測(cè)分別于糖尿病建模前、實(shí)驗(yàn)?zāi)┻M(jìn)行常規(guī)超聲心動(dòng)圖檢查，測(cè)定如下指標(biāo)：M型超聲心動(dòng)圖測(cè)定左室收縮末

3、內(nèi)徑、左室舒張末內(nèi)徑、射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率；彩色多普勒超聲心動(dòng)圖觀察瓣膜返流情況；脈沖及連續(xù)多普勒超聲心動(dòng)圖測(cè)定二尖瓣E波最大速度、A波最大速度、E/A比值、E波減速時(shí)間、等容舒張時(shí)間、主動(dòng)脈血流最大速度。 3.心肌組織病理學(xué)檢查及Masson三色染色動(dòng)物處死后，進(jìn)行組織取材、固定、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)并拍片；行Masson三色染色，觀察膠原分布形態(tài)并定量分析心肌組織膠原含量。

4、 4.TUNEL，染色發(fā)鑒定凋亡細(xì)胞取組織切片，進(jìn)行TUNEL染色，觀察細(xì)胞凋亡水平。 5.實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)分別從左室組織提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)得到cDNA，以GAPDH作為參照，通過(guò)real-time PCR技術(shù)檢測(cè)GRP78、Caspase 12、CHOP的表達(dá)。 6.免疫組織化學(xué)檢測(cè)取組織切片，進(jìn)行GRP78免疫組織化學(xué)檢測(cè)，所用-抗為GRP78多克隆抗體(SantaCruz公司，1:400稀

5、釋)。 7.免疫印跡檢測(cè)取左室組織，提取總蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印記、ECL顯色等步驟，檢測(cè)GRP78、Caspase12、p-JNK的蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基本情況及血糖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，體重增加明顯，反應(yīng)敏捷，毛色白而光澤。DCM組大鼠出現(xiàn)多食、多飲、多尿和消瘦等癥狀，體重增加遲緩，精神萎靡，皮毛無(wú)光澤，部分出現(xiàn)爛尾、白內(nèi)障等。

6、整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中2只大鼠死亡，均為DCM組，死亡原因可能與糖尿病酮癥酸中毒、感染或其他相關(guān)并發(fā)癥有關(guān)。另有1只大鼠血糖未達(dá)成模標(biāo)準(zhǔn)，予以剔除。最終共27只完成實(shí)驗(yàn)，其中對(duì)照組10只，DCM組17只。 注射STZ之前，對(duì)照組與DCM組血糖無(wú)明顯差異(P＞0.05)。注射STZ 1周后，DCM組血糖明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，并持續(xù)至實(shí)驗(yàn)?zāi)?2.超聲心動(dòng)圖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)初，對(duì)照組及DCM組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)(包括LVI

7、Ds、LVIDd、EF、FS、瓣膜返流、E波最大速度、A波最大速度、E/A比值、EAT、EDT)無(wú)顯著性差異。實(shí)驗(yàn)?zāi)珼CM組大鼠LVIDs及LVIDd明顯增加，房室瓣瓣膜返流發(fā)生率明顯增加，E波最大速度下降，A波最大速度增快，E/A比值下降，F(xiàn)S降低，APV降低，EDT無(wú)顯著性差異。 3.心肌組織病理學(xué)檢查及Masson三色染色HE染色切片上，對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核大小均一，胞漿染色均勻；DCM組心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞

8、核大小不甚規(guī)則。 Masson三色染色：心肌細(xì)胞染色呈紅色，間質(zhì)膠原呈藍(lán)綠色，紅細(xì)胞呈橘黃色。對(duì)照組心肌膠原組織分布均勻，DCM組心肌橫切面可見心肌內(nèi)膠原組織明顯增多，粗大膠原纖維相互連接成網(wǎng)狀，排列紊亂，分布不勻，緊密圍繞于心肌細(xì)胞周圍及小血管周圍。定量分析顯示，左室心肌組織膠原含量在DCM組明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。 4. TUNEL染色法與對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠心肌細(xì)胞凋亡明顯增加(P＜0.05)。

9、 5.實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)與對(duì)照組相比，DCM組左室GRP78、CHOP及Caspase12的mRNA表達(dá)均明顯增高(P＜0.05)。 6.免疫組織化學(xué)檢測(cè)GRP78：對(duì)照組心肌組織內(nèi)可見少量、分布均勻、稀疏的淺棕色顆粒，主要定位于心肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞；DCM組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見濃密的深棕色顆粒，同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞亦見明顯表達(dá)。 7.免疫印跡檢測(cè)與對(duì)照組相比，DCM組左室組織蛋白GRP78、CHOP、Caspase12及p

10、-JNK表達(dá)均明顯增高(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.通過(guò)腹腔注射STZ并喂養(yǎng)5個(gè)月，成功建立了糖尿病性心肌病大鼠模型，為DCM發(fā)病機(jī)制的研究提供了可靠的平臺(tái)； 2.心肌細(xì)胞凋亡增加、膠原組織沉積、心肌纖維化是DCM時(shí)的主要組織病理改變； 3.心臟舒張功能異常是DCM時(shí)的主要功能改變； 4.DCM大鼠心肌組織GRP78、CHOP、Caspase12及p-JNK表達(dá)增高，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的心肌細(xì)胞

11、凋亡在DCM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 第二部分高同型半胱氨酸血癥通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn) 研究背景：同型半胱氨酸是一種具有毒性的非蛋白類含硫氨基酸，它在體內(nèi)通過(guò)轉(zhuǎn)硫作用和去甲基作用被代謝。5-7％的人群中存在高同型半胱氨酸血癥。目前的證據(jù)表明HHcy是多種疾病獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這些疾病包括：動(dòng)脈硬化，糖尿病，脂肪肝，以及神經(jīng)退行性變?nèi)缗两鹕C合癥等。 有關(guān)Hcy能夠引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的學(xué)說(shuō)目前越來(lái)越受到

12、關(guān)注。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生理功能包括蛋白質(zhì)的合成、折疊和釋放以及鈣的貯存和調(diào)節(jié)，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白增多以至堆積時(shí)就會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，其中一個(gè)步驟就包括非折疊蛋白反應(yīng)，后者是通過(guò)GRP78激活后續(xù)的信號(hào)通路最終引起細(xì)胞程序性死亡。Hcy能夠破壞蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)雙硫鍵的合成，造成蛋白的錯(cuò)誤折疊，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。研究表明Hcy能夠引起多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異性的基因的表達(dá)，如GRP78，GRP94等，但是Hcy引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)以及相關(guān)基

13、因的表達(dá)目前尚未清楚。 盡管HHcy已被認(rèn)為是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并且HHcy與糖尿病心肌病的關(guān)系已得到證實(shí)，但多數(shù)研究集中關(guān)注在HHcy對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌的作用上，有關(guān)HHcy與糖尿病心肌病中心肌細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，而細(xì)胞凋亡在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用。我們前一部分的研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠的心肌內(nèi)，有關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)因子如GRP78，Caspase12，p-JNK，CHOP均較正常大鼠表達(dá)

14、升高，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是導(dǎo)致糖尿病心肌病心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一；此外，我們對(duì)大鼠進(jìn)行體內(nèi)Hcy的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著糖尿病病程的進(jìn)展，大鼠體內(nèi)總Hcy呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì)，最終出現(xiàn)HHcy。因此我們擬在本研究中，進(jìn)行體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)，以觀察HHcy對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響，及與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系。 目的： 1.觀察同型半胱氨酸刺激是否能夠加速培養(yǎng)的心肌細(xì)胞凋亡。 2.觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑是否參與同型半胱氨酸誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡

15、過(guò)程。方法1.心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng)無(wú)菌條件下取出Wistar乳鼠的心臟，剪碎,胰酶消化，差速貼壁去除成纖維細(xì)胞。生長(zhǎng)至融合狀態(tài)，見明顯的心肌搏動(dòng)，1:1傳代，采用2-3代心肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 1)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞分別加入不同濃度的同型半胱氨酸(0.025、0.1、1mM)刺激，后進(jìn)行TUNEL染色判斷心肌細(xì)胞凋亡情況。并甄選出最佳同型半胱氨酸刺激濃度。 2)將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞給予同型半胱氨酸刺激后收集，分

16、別測(cè)定GRP78，Caspase12，CHOP及p-JNK的表達(dá)水平。 3.TUNEL法測(cè)定心肌細(xì)胞的凋亡水平將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞固定，后進(jìn)行TUNEL染色，測(cè)定心肌細(xì)胞的凋亡水平。 4.實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)GRP78，Caspase12及CHOP的mRNA表達(dá)將所收集的細(xì)胞提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，以GAPDH作為參照，通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)GRP78，Caspase12及CHOP的mRNA表達(dá)。

17、 5.Western blot檢測(cè)GRP78，Caspase12，CHOP及p-JNK的蛋白表達(dá)將所收集的細(xì)胞提取總蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印記、熒光顯色等步驟，檢測(cè)GRP78，Caspase12，CHOP及p-JNK的蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果： 1.同型半胱氨酸對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞凋亡水平的影響TUNEL染色顯示，與正常組對(duì)照，經(jīng)過(guò)同型半胱氨酸刺激的心肌細(xì)胞的凋亡水平明顯增高，并