MAPK信號(hào)通路在糖尿病性心肌病炎性反應(yīng)中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　本課題通過(guò)對(duì)大鼠胚胎心肌細(xì)胞（H9c2）進(jìn)行高糖高脂干預(yù)，建造糖尿病心肌病肥厚模型，通過(guò)檢測(cè)MAPK信號(hào)蛋白明確其對(duì)糖尿病心肌病中炎性反應(yīng)的影響。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)分為三部分：（1）采用隨機(jī)數(shù)字表法，將體外培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分組，每組設(shè)6個(gè)平行孔：對(duì)照組、高糖高脂A（葡萄糖33mmol/L+棕櫚酸鈉250μmol/L）、高糖高脂B（葡萄糖33mmol/L+棕櫚酸鈉500μmol/L）、高糖高脂C

2、（葡萄糖33mmol/L+棕櫚酸鈉1000μmol/L）不同時(shí)間（12h、24h、36h、48h)處理組。采用熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)分別檢測(cè)心肌肥大相關(guān)指標(biāo)心房鈉尿肽（ANP）、α-肌動(dòng)蛋白（α-SKA）的mRNA表達(dá)；利用蘇木精-伊紅染色法（HE染色）對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察高糖高脂對(duì)H9c2心肌細(xì)胞肥大程度的影響；檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）活性，觀察高糖高脂對(duì)H9c2心肌細(xì)胞損傷程度的影響。（2）結(jié)合第一部分實(shí)

3、驗(yàn)，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞分組，每組設(shè)立6個(gè)平行對(duì)照孔：對(duì)照組、高糖高脂組（葡萄糖33mmol/L+棕櫚酸鈉500μmol/L）處理24小時(shí)。利用蛋白免疫印跡(Western blot)技術(shù)檢測(cè) p-ERK/T-ERK、p-JNK/T-JNK、p-p38/T-p38的活化程度，觀察高糖高脂與MAPK家族信號(hào)活化關(guān)系。（3）結(jié)合前兩部分實(shí)驗(yàn)，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞分組，每組設(shè)立6個(gè)平行對(duì)照孔，對(duì)

4、照組、高糖高脂組、抑制劑組（SB203580+高糖高脂組）。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中活性氧（ROS）的含量；通過(guò)化學(xué)檢測(cè)法檢測(cè)各組一氧化氮（NO）的水平；ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞3-硝基酪氨酸（3-NT）、白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）的分泌程度，觀察高糖高脂對(duì)H9c2心肌細(xì)胞炎癥通路的影響及MAPK家族與炎性反應(yīng)之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.高糖高脂處理導(dǎo)致H9c2細(xì)胞呈時(shí)間和濃度依賴性肥大和損

5、傷。與對(duì)照組相比，高糖高脂處理后，ANP表達(dá)隨著濃度和時(shí)間的逐漸增加而升高，且在36h高糖高脂B處理組ANP的表達(dá)量達(dá)到高峰（P<0.01）；相比對(duì)照組而言，高糖高脂促進(jìn)α-SKA表達(dá)，但α-SKA的表達(dá)在36h高糖高脂B處理組達(dá)到最高（P<0.05），與ANP的結(jié)果一致；與對(duì)照組相比，H9c2細(xì)胞的表面積變化與高糖高脂呈時(shí)間濃度依賴性，此外在36h高糖高脂B處理組，細(xì)胞的表面積變化最顯著（P<0.01），但36h高糖高脂C處理組的細(xì)胞

6、形態(tài)改變異常；同時(shí)H9c2細(xì)胞上清中LDH的活性與高糖高脂處理間呈濃度及時(shí)間依賴性（P<0.05)。據(jù)此，采用高糖高脂B（葡萄糖33mmol/L+棕櫚酸鈉500μmol/L）干預(yù)細(xì)胞36h為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度和時(shí)間。
　　2.高糖高脂處理后 H9c2細(xì)胞MAPK信號(hào)途徑顯著活化。與對(duì)照組相比，高糖高脂組中 ERK、JNK、p38磷酸化水平明顯提高，其中p-ERK和p-JNK的水平分別增加了1.39倍和1.47倍（P<0.05），而

7、p-p38的活化水平增加了3.34倍（P<0.01）。
　　3.高糖高脂顯著誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)變化并可被p38 MAPK抑制劑抑制。與高糖高脂組相比，抑制劑組（SB203580+高糖高脂組）可降低ROS含量、NO水平、3-NT含量、IL-6和IL-1β的分泌量（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.高糖高脂可增加ANP及α-SKA的表達(dá)并使H9c2細(xì)胞表面積顯著增加，且可使細(xì)胞上清中的LDH水平升高，這提示高糖高脂可顯著誘導(dǎo)