脂多糖對(duì)大鼠胰島瘤細(xì)胞INS-1自噬和凋亡的影響.pdf

1、背景：
　　 2型糖尿病患者胰島β細(xì)胞的數(shù)量和功能與非糖尿病患者相比顯著不同，主要表現(xiàn)為數(shù)量減少和功能下降。研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者β細(xì)胞的死亡率要顯著高于非糖尿病人，其中大部分細(xì)胞經(jīng)過(guò)凋亡途徑死亡，不可忽視的是還有相當(dāng)一部分細(xì)胞的死亡是由于自噬引起的，這說(shuō)明自噬也在一定程度上參與β細(xì)胞的衰竭。自噬是一個(gè)在進(jìn)化上非常保守的過(guò)程，在正常條件下其作用主要是清除、降解細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)壽命蛋白和受損細(xì)胞器，通過(guò)這種方式實(shí)現(xiàn)自身的代謝需要和某些細(xì)

2、胞器的更新，對(duì)維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有重要意義。而在各種應(yīng)激狀態(tài)下，如營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，細(xì)胞則可通過(guò)自噬將一些不必要的蛋白加以降解，為代謝提供能量和一些必要的營(yíng)養(yǎng)成分，所以自噬對(duì)于維持細(xì)胞的生存也是至關(guān)重要的。但是另一方面，自噬也和凋亡一樣被認(rèn)為是一種程序性細(xì)胞死亡機(jī)制，在某些情況下可導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。糖尿病患者體內(nèi)環(huán)境與非糖尿病患者顯著不同，主要變現(xiàn)為高血糖、高血脂、血粘度增高及低度慢性炎癥等。體外研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲霉素、游離脂肪酸、高糖等均可誘導(dǎo)胰島

3、β細(xì)胞的自噬，但作為伴隨糖尿病發(fā)生發(fā)展的炎性因子能否誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞的自噬，尚未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在利用脂多糖(LPS)作為誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的介質(zhì)，觀察炎性反應(yīng)對(duì)胰島瘤細(xì)胞INS-1自噬和凋亡的影響及其可能的機(jī)制，從而為2型糖尿病的預(yù)防及其治療提供一定的依據(jù)。
　　 目的：
　　 研究誘導(dǎo)炎性反應(yīng)的介質(zhì)脂多糖(LPS)對(duì)大鼠胰島瘤細(xì)胞INS-1自噬和凋亡的影響及其可能的機(jī)制。
　　 方法：
　　 (1)取處于對(duì)數(shù)期

4、INS-1細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，分別用0.1、1.0、10.0 mg/L LPS處理細(xì)胞，24h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，用磺酰羅丹明B(SRB)染色法檢測(cè)LPS對(duì)INS-1細(xì)胞增殖的影響，用二氯熒光素雙醋酸鹽(DCFH-DA)作為熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平變化，應(yīng)用Westem blotting檢測(cè)細(xì)胞自噬體膜上自噬標(biāo)志分子-微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)和凋亡標(biāo)志蛋白-聚腺苷二磷酸-核糖多聚酶（PARP）的切割帶的變化。(

5、2)將INS-1細(xì)胞的自噬必需基因7(Atg7)通過(guò)siRNA介導(dǎo)的RNA干擾手段進(jìn)行沉默，然后以1 mg/L的LPS處理細(xì)胞，24h后應(yīng)用Westem blot檢測(cè)細(xì)胞中的Atg7、LC3-Ⅱ和PARP切割帶，以確定LPS所誘導(dǎo)的自噬對(duì)INS-1細(xì)胞凋亡的影響；(3)先用400μmol/L的活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)處理INS-1細(xì)胞，1小時(shí)后加入10 mg/L的LPS，24h后應(yīng)用Westem blot檢測(cè)LC3-Ⅱ蛋白

6、和PARP切割蛋白，以確定LPS是否通過(guò)刺激活性氧的產(chǎn)生而誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞的自噬和凋亡。
　　 結(jié)果：
　　 (1)0.1、1.0、10.0 mg/L LPS干預(yù)24h后，細(xì)胞皺縮、變小變圓，凋亡增加；與對(duì)照組（0.755±0.030）比較，0.1、1.0、10.0 mg/L LPS組存活率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為0.658±0.042、0.658±0.015、0.634±0.029，F(xiàn)=30.98，P＜0.01

7、）；與對(duì)照組（0.447±0.012）相比，0.1、1.0、10.0 mg/L LPS組LC3-Ⅱ蛋白水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為0.992±0.030、0.949±0.020、0.982±0.013，F(xiàn)=525.79，P＜0.01）；與對(duì)照組（0.055±0.001）相比，0.1、1.0、10.0 mg/L LPS組PARP切割蛋白水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為0.313±0.007、0.390±0.011、0.500±0.

8、033，F(xiàn)=327.09，均P＜0.01）；與對(duì)照組比較，10 mg/L LPS組活性氧產(chǎn)生明顯增多。(2)與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染Atg7 siRNA組Atg7、LC3-Ⅱ和PARP切割蛋白水平均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=156.069、123.154、103.246，均P＜0.01）。(3)與LPS10.0 mg/L組比較，LPS10.0 mg/L+NAC組LC3-Ⅱ和PARP切割蛋白水平均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=66.