骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：檢測(cè)pcDNA3-FGF-β1 表達(dá)載體瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 TGF-β1蛋白表達(dá)的影響及其誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向分化的可行性，為修復(fù)軟骨損傷的實(shí)驗(yàn)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：用密度梯度離心法和貼壁法分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并傳代擴(kuò)增后，通過(guò)免疫組織化學(xué)鑒定細(xì)胞。脂質(zhì)體介導(dǎo) pcDNA3-TGF-β1 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染第三代兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，免疫組化法檢測(cè)法檢測(cè)瞬時(shí) TGF-β1 蛋白表達(dá)。應(yīng)用G418篩

2、選陽(yáng)性克隆，同法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組細(xì)胞 TGF-β1 蛋白表達(dá)。持續(xù)培養(yǎng)各組細(xì)胞，連續(xù)觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并記錄其特點(diǎn)，以未轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對(duì)照組，培養(yǎng)2周、4周后檢測(cè)各組細(xì)胞型Ⅱ膠原的表達(dá)情況。 結(jié)果：體外成功建立兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分離擴(kuò)增傳代的方法。免疫組化結(jié)果顯示pcDNA3-TGF-β1 表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)有TGF-β1 蛋白表達(dá)。經(jīng)G418篩選2周，獲得穩(wěn)定表達(dá)克隆，免疫組化結(jié)果顯示：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

3、組細(xì)胞有明顯的TGF-β1 蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞第 2 周，抗Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)組可見細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性顆粒，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組均為陰性，培養(yǎng)4周后細(xì)胞形態(tài)變?yōu)?角型，實(shí)驗(yàn)組有明顯Ⅱ型膠原表達(dá)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組均為陰性實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論：脂質(zhì)體法重組 pcDNA3-TGF-β1 基因可成功轉(zhuǎn)染兔 MSCs，轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)TGF-β1，并可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原蛋白，表