白藜蘆醇在β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、阿爾茨海默病是老年人中最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性病。該病的主要病理學(xué)特征為腦內(nèi)神經(jīng)元斑塊沉積和神經(jīng)原纖維纏結(jié)，并引發(fā)神經(jīng)突觸和腦內(nèi)神經(jīng)元缺失。隨著世界人口的老齡化加劇，阿爾茨海默病的發(fā)病率日趨上升，已成為當(dāng)前老年醫(yī)學(xué)面臨的最為嚴(yán)峻的問(wèn)題之一，然而，目前尚不清楚神經(jīng)元退變損傷的分子機(jī)制，臨床上對(duì)阿爾茨海默病亦缺乏有效地治療手段。
　　 研究表明，β-淀粉樣蛋白（β-amyloidprotein，Aβ）的沉積是阿爾茨海默病的始發(fā)因素和關(guān)鍵環(huán)

2、節(jié)，是腦內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失的直接因素。Aβ可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，降低Aβ細(xì)胞毒性、抑制Aβ異常沉積已成為研究阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制，尋找治療方法的關(guān)鍵點(diǎn)。近年來(lái)有關(guān)中藥治療阿爾茨海默病的研究越來(lái)越多。白藜蘆醇是一類廣泛存在于葡萄、虎杖等植物中的多酚類化合物。具有抗氧化、抗炎癥、抗癌及抗衰老等作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對(duì)H2O2、MPP、Aβ及6-羥多巴胺誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中都有一定的保護(hù)作用，并能夠有效延緩阿爾

3、茨海默病和亨汀頓舞蹈癥的認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶與行為功能障礙。白藜蘆醇對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用已經(jīng)引起神經(jīng)科學(xué)家的廣泛關(guān)注。
　　 白藜蘆醇可以通過(guò)調(diào)控多個(gè)基因和信號(hào)通路而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能誘導(dǎo)沉默信號(hào)調(diào)控因子(Silencesignalregulatingfator1，SIRT1)的高表達(dá)，從而引起一系列信號(hào)通路的改變。SIRT1是沉默信號(hào)調(diào)控因子sir-2的同源物，它參與基因轉(zhuǎn)錄、延長(zhǎng)復(fù)制周期、能量代謝及延緩細(xì)胞衰

4、老等生物過(guò)程。在阿爾茨海默病模型大鼠研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠腦內(nèi)SIRT1高表達(dá)能增強(qiáng)淀粉樣前體蛋白(Amyloidprecursorprotein，APP)的非淀粉樣蛋白分解途徑，減少Aβ的沉積。
　　 在SIRT1對(duì)阿爾茨海默病的保護(hù)機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，SIRT1轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)源的原代神經(jīng)元中，β-淀粉樣蛋白含量減少，同時(shí)ROCK1的表達(dá)降低。以往的研究也發(fā)現(xiàn)，ROCK1能夠調(diào)節(jié)α-蛋白激酶活性，與淀粉樣前體蛋白的代謝有關(guān)。這說(shuō)明SIRT

5、1增強(qiáng)α-分泌酶介導(dǎo)的APP非淀粉樣蛋白途徑可能部分通過(guò)ROCK1通路，然而，SIRT1與ROCK1之間的調(diào)控關(guān)系以及二者在白藜蘆醇對(duì)抗Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷中的作用并不清楚。
　　 基于以上的研究，為探討白藜蘆醇對(duì)Aβ25-35毀損神經(jīng)元的保護(hù)作用，并探討SIRT1和ROCK1在該過(guò)程中的作用機(jī)制，我們?cè)O(shè)計(jì)了本項(xiàng)實(shí)驗(yàn):(1)選用PC12細(xì)胞作為神經(jīng)元培養(yǎng)模型，加入不同濃度的Aβ25-35，觀察Aβ25-35對(duì)PC12細(xì)胞的損傷情況

6、;(2)在Aβ25-35毀損PC12細(xì)胞的培養(yǎng)基內(nèi)加入不同濃度的白藜蘆醇，通過(guò)MTT和LDH檢測(cè)，觀察白藜蘆醇對(duì)Aβ25-35損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用，并分析篩選出其最佳保護(hù)濃度;(3)通過(guò)Hoechst33342/PI雙染、流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度檢測(cè)分析白藜蘆醇對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡情況的影響;(4)為進(jìn)一步探討探討白藜蘆醇發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制，我們應(yīng)用RT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)了SIR

7、T和ROCK1在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)變化;(5)應(yīng)用尼克酰胺（SIRT1的抑制劑）和Y-27632(ROCK1的抑制劑)處理PC12細(xì)胞，進(jìn)一步明確SIRT1及ROCK1在白藜蘆醇對(duì)抗Aβ25-35毀損PC12細(xì)胞中的作用及二者之間的調(diào)控關(guān)系。
　　 本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，
　　 (1)給予10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L的Aβ25-35毀損PC12細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞的突起從遠(yuǎn)端開(kāi)始崩解、碎裂。隨

8、著Aβ25-35濃度的升高，PC12細(xì)胞毀損逐漸加重。MTT結(jié)果顯示細(xì)胞活性與Aβ25-35濃度呈負(fù)相關(guān)。在Aβ25-35的三個(gè)濃度組中，20μmol/L濃度傷易于觀察與檢測(cè)，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞損傷的選用濃度。在Aβ25-35毀損前2h，給予12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L及100μmol/L四個(gè)濃度的白藜蘆醇預(yù)孵育PC12細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)觀察及MTT、LDH細(xì)胞活性分析，各濃度組均呈現(xiàn)明顯的保護(hù)作用（P＜0.0

9、1），其中50μmol/L白藜蘆醇保護(hù)組的保護(hù)作用強(qiáng)于其他濃度組(P＜0.01），選為研究白藜蘆醇保護(hù)作用的使用濃度。
　　 (2)Hoechst33342/PI雙染結(jié)果顯示，白藜蘆醇保護(hù)組的細(xì)胞凋亡率明顯低于Aβ25-35損傷組(P＜0.01);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，白藜蘆醇能夠有效地同時(shí)抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的早期凋亡和晚期凋亡(P＜0.01);細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度檢測(cè)結(jié)果顯示，Aβ25-35損傷組細(xì)胞鈣離子熒光強(qiáng)度較空白對(duì)照

10、組明顯增強(qiáng)，鈣離子濃度顯著升高，給予白藜蘆醇保護(hù)以后，鈣離子熒光強(qiáng)度較Aβ25-35損傷組明顯減弱(P＜0.01)。
　　 (3)RT-PCR和Westernblot的結(jié)果均顯示，Aβ25-35抑制SIRT1的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)ROCK1的表達(dá)（P＜0.01），給予白藜蘆醇后，可明顯增加PC12細(xì)胞SIRT1表達(dá)，降低ROCK1表達(dá)（P＜0.01）。為進(jìn)一步明確SIRT1及ROCK1的作用及調(diào)控關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了SIRT1的抑制劑尼

11、克酰胺和ROCK1的抑制劑Y-27632，結(jié)果顯示，尼克酰胺顯著地抑制SIRT1的表達(dá)并激活ROCK1的表達(dá)(P＜0.01);Y-27632明顯抑制ROCK1的表達(dá)（P＜0.01），而對(duì)SIRT1的表達(dá)幾乎沒(méi)有影響。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，ROCK1是SIRT1下游的一個(gè)信號(hào)分子，并且受SIRT1的負(fù)調(diào)控。
　　 本項(xiàng)研究表明，白藜蘆醇通過(guò)激活SIRT1進(jìn)而抑制其下游信號(hào)分子ROCK1，對(duì)抗β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保