水飛薊素對(duì)丙烯酰胺所致PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用.pdf

1、丙烯酰胺（Acrylamide，AA）主要應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域，對(duì)人或動(dòng)物具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、遺傳毒性和致癌性。近些年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)含淀粉類的食品在經(jīng)過(guò)高溫加工(≥120℃)過(guò)程中由于發(fā)生了美拉德反應(yīng)會(huì)形成AA。因此，預(yù)防和抑制食品中AA對(duì)人類造成的損傷是非常必要的。植物化學(xué)物質(zhì)自身具有強(qiáng)生物活性和良好的藥用價(jià)值而被廣泛關(guān)注，從水飛薊中提取的水飛薊素(Silymarin，SM)作為天然黃酮類混合物的一種，不僅具有強(qiáng)抗炎和抗氧化活性，還對(duì)體內(nèi)

2、AA代謝過(guò)程的相關(guān)酶系具有抑制作用。故本研究以PC12細(xì)胞為神經(jīng)系統(tǒng)及氧化應(yīng)激模型，利用體外試驗(yàn)探討SM預(yù)防AA神經(jīng)毒性的作用及機(jī)制，從而為降低食品中AA對(duì)人類造成的損害提供新思路。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴MTT(ThiazolylBlue，MTT)法檢測(cè)AA對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度(1.25，2.5，5，10，20 mM) AA孵育12h、24 h及48 h后的PC12細(xì)胞，相比正常培養(yǎng)的細(xì)胞，其細(xì)胞存

3、活率下降，且與孵育時(shí)間和劑量成正相關(guān)性。選用5 mM24 h作為本試驗(yàn)AA染毒的作用濃度和作用時(shí)間，此作用條件下細(xì)胞的存活率為61％。⑵MTT法檢測(cè)SM對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響和SM對(duì)AA所致PC12細(xì)胞毒性的保護(hù)作用。PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度(12，24，48，96，192μg/mL) SM孵育12h，結(jié)果顯示，其細(xì)胞存活率與無(wú)SM作用正常條件培養(yǎng)的細(xì)胞相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(P＞0.05)，說(shuō)明SM對(duì)PC12細(xì)胞增殖沒有影響;PC12細(xì)

4、胞先經(jīng)不同濃度(12，24，48，96，192μg/mL) SM分別作用1.5h、3h及6h，再用5 mMAA作用24 h，結(jié)果顯示，SM能夠提高PC12細(xì)胞的存活率，并與劑量成正相關(guān)性，且作用時(shí)間為3h時(shí)，SM對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)效果最佳，故本試驗(yàn)選用3h作為SM的作用時(shí)間。⑶倒置顯微鏡觀察SM對(duì)AA所致PC12細(xì)胞毒性的保護(hù)作用發(fā)現(xiàn)，SM能夠有效的改善AA所致的細(xì)胞貼壁率下降。⑷系統(tǒng)評(píng)估了SM對(duì)AA所致PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

5、。PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度(12，24，48，96，192μg/mL) SM作用3h后，再用5 mM AA染毒24 h。結(jié)果證明，SM能劑量依賴性的降低AA引起的細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的升高，同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)的含量。⑸實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PC12細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Gpx)、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)和谷氨酸半胱氨酸連接酶修飾亞基(GCLM)的mRNA含量

6、變化。PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度（12，24，48，96，192μg/mL）SM作用3h后，再用5 mM AA染毒24 h。結(jié)果顯示，相比對(duì)照組（僅AA染毒24 h的PC12細(xì)胞），SM提高了細(xì)胞內(nèi)Nrf2，Gpx，GCLC和GCLM的mRNA含量，且與劑量成正相關(guān)性。⑹Western blot法檢測(cè)PC12細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Nrf2、細(xì)胞核內(nèi)Nrf2及胞內(nèi)Gpx、GCLC和GCLM蛋白的含量。PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度(12，24，48，96，192μ