高鹽飲食誘導(dǎo)Caveolin-1上調(diào)促發(fā)糖尿病血管功能障礙.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病主要表現(xiàn)高血糖癥和血管的進(jìn)行性損傷，并伴隨著心血管疾病的發(fā)生，已成為全球性的主要健康問(wèn)題。高血壓是導(dǎo)致心血管疾病最常見的危險(xiǎn)因子，糖尿病患者高血壓發(fā)病率高于正常人群，增加對(duì)高血壓危險(xiǎn)因素的敏感性。并且，糖尿病合并高血壓患者與單純高血壓患者或單純的糖尿病患者相比，其心血管并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)和血管進(jìn)行性損傷顯著增加。因此闡明糖尿病狀態(tài)下對(duì)高血壓易感性增加的機(jī)制是降低糖尿病患者高血壓發(fā)病率及死亡率的關(guān)鍵。
　　高鹽飲

2、食是高血壓危險(xiǎn)因素中最常見的一種。流行病學(xué)研究已明確高鹽飲食會(huì)導(dǎo)致血壓升高并增加日后患心臟病和中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)，但其機(jī)制仍不清楚。高鹽飲食促進(jìn)血管收縮可能與增加血管收縮因子內(nèi)皮收縮因子-1的核表達(dá)，鈉/鈣交換機(jī)制的增強(qiáng)，活性氧簇ROS的增加，一氧化氮（NO）活性的減低有關(guān)。自發(fā)性高血壓大鼠的胰島素誘導(dǎo)的NO舒張能力及Akt/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性下降。高鹽對(duì)糖尿病

3、患者的血壓同樣起著重要的作用。但是高鹽飲食導(dǎo)致的內(nèi)皮功能損害，使糖尿病患者更易伴發(fā)高血壓的機(jī)制仍不清楚。
　　窖蛋白（caveolin）/脂質(zhì)筏是膜特殊的微結(jié)構(gòu)，是多分子信號(hào)傳遞的區(qū)域。細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)分子是通過(guò)與窖蛋白 Cav-1（caveolin-1，Cav-1）的相互作用完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。Cav-1在很多細(xì)胞上都有表達(dá)，如內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和纖維母細(xì)胞。有研究提示，Cav-1是連接胰島素抵抗和高血壓發(fā)病之間重要的信

4、號(hào)分子[1]。有研究發(fā)現(xiàn)Cav-1與eNOS共同錨定在窖蛋白，限定了eNOS的轉(zhuǎn)位、磷酸化，維持eNOS未被激活的狀態(tài)。也有實(shí)驗(yàn)顯示糖尿病患者的Cav-1表達(dá)增加。但是eNOS和Cav-1之間的相互作用在糖尿病內(nèi)皮功能障礙中的作用仍不清楚。本研究將從Cav-1和eNOS之間的相互作用探討糖尿病狀態(tài)下高鹽飲食引發(fā)高血壓的易感性及其信號(hào)機(jī)制，期望為臨床更有效治療糖尿病罹患高血壓患者提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　1.研究

5、糖尿病狀態(tài)下給予高鹽飲食是否加重血管功能障礙；
　　2.若是，進(jìn)一步研究血管損害的分子機(jī)制，主要探討Cav-1在其中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.糖尿病大鼠模型制備及實(shí)驗(yàn)分組：SD大鼠(150 g-180 g)120只，腹腔注射鏈唑霉素（STZ,70 mg·kg-1），3天后空腹血糖≥16.7 mM為1型糖尿病大鼠(DM)。正常大鼠和糖尿病大鼠分別給予正常飲食(CON)和高鹽飲食（HS,8％ NaCl）6周(HS，

6、DM+HS)。每周測(cè)血壓和空腹血糖。
　　2.分別于3周，6周離體觀察外周阻力血管收縮舒張功能。腸系膜三級(jí)動(dòng)脈剪成1 mm長(zhǎng)的血管環(huán)，用苯腎上腺素（PE,1μM)，產(chǎn)生約13.2-20.0 mN預(yù)收縮。ACh(10-10-10-6 mol/L)，胰島素(10-10-10-6 mol/L)，SNP(10-8-10-4 mol/L)觀察血管的舒張功能。檢測(cè)血漿中的 NOx濃度，血管ROS的水平。
　　3. HE染色觀察腸系膜動(dòng)脈

7、的結(jié)構(gòu)變化。
　　4.免疫熒光雙染檢測(cè)主動(dòng)脈eNOS、Cav-1的表達(dá)和分布。為明確Cav-1和eNOS的關(guān)系，免疫共沉淀觀察腸系膜動(dòng)脈兩者的相互關(guān)系。
　　5.采用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)Akt、eNOS和Cav-1的表達(dá)水平。
　　6. HUVEC培養(yǎng)給予wortmannin、L-NAME及Cav-1 siRNA,免疫印跡技術(shù)檢測(cè)觀察Cav-1與eNOS之間的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組相比，HS組

8、高鹽飲食收縮壓逐漸升高，至6周時(shí)收縮壓達(dá)143±10 mmHg。證實(shí)高鹽飲食確可誘導(dǎo)發(fā)生高血壓。與對(duì)照組相比，單純DM組3周和6周的收縮壓與正常組無(wú)顯著區(qū)別。但是，在DM+HS組，高鹽飲食1周后即出現(xiàn)收縮壓和舒張壓升高，3周后收縮壓達(dá)151±11 mmHg，至6周時(shí)收縮壓達(dá)169±11 mmHg，明顯高于HS組（P<0.01）。該結(jié)果表明在糖尿病狀態(tài)下HS誘發(fā)血壓升高的時(shí)間顯著縮短。
　　2.離體觀察外周阻力血管舒張功能結(jié)果顯示：

9、與對(duì)照組相比，單獨(dú) DM組和單獨(dú) HS組3周時(shí) ACh和胰島素引起的內(nèi)皮依賴性舒張作用開始出現(xiàn)降低（P<0.01），但 SNP的血管舒張作用未見明顯下降。DM+HS組 ACh和胰島素引起的內(nèi)皮依賴性舒張作用明顯低于其他組（P<0.01）。6周時(shí)，單獨(dú)DM組(42.0±4.5%，P<0.01)和單獨(dú)HS組(22.3±4.1%，P<0.05) ACh和胰島素引起的內(nèi)皮依賴性舒張作用進(jìn)一步降低，但SNP的血管舒張作用仍未見明顯下降。DM+HS

10、組不但 ACh和胰島素引起的內(nèi)皮依賴性舒張作用進(jìn)一步減退（P<0.01），而且SNP的對(duì)血管的直接舒張作用也明顯降低（P<0.01）。3周DM+HS組血管組織NOx濃度較單獨(dú)HS顯著降低（P<0.01）。至6周時(shí)，NO水平進(jìn)一步減退（P<0.01）。上述結(jié)果提示，糖尿病狀態(tài)下 HS導(dǎo)致血管舒張功能障礙的時(shí)程顯著提前。并且，DM+HS對(duì)阻力血管的損傷程度也顯著加重。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，6周DM+HS組血管組織的ROS水平顯著高于單獨(dú)DM組和單純HS

11、組。
　　3.為進(jìn)一步明確DM+HS促發(fā)高血壓的損傷程度，采用形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，6周后，DM+HS組的血管壁厚度要比單獨(dú) HS組顯著減小（P<0.01）。提示 DM+HS組血管損傷顯著加重。與上述功能學(xué)結(jié)果相一致。
　　4.更為重要的是，在單獨(dú)DM和單獨(dú)HS和DM+HS組均觀察到eNOS和Cav-1共同表達(dá)于主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，但DM+HS組的eNOS與Cav-1共定位有所增加。DM+HS組中免疫共沉淀結(jié)果顯示eNOS與Cav-1

12、形成復(fù)合物顯著增加。
　　5. DM組在3周時(shí)，血管組織p-Akt，p-eNOS水平顯著降低（P<0.01）。HS組，p-eNOS水平有降低趨勢(shì)。但DM+HS組p-Akt，p-eNOS水平顯著低于單獨(dú)HS組。3周時(shí)DM組血管組織Cav-1水平略有升高，HS組，Cav-1升高較為明顯，而DM+HS組的Cav-1顯著高于其他各組。結(jié)果表明DM+HS可將Cav-1上調(diào)時(shí)間點(diǎn)顯著提前。6周時(shí)，單獨(dú)DM和單獨(dú)HS組p-eNOS均顯著降低，C

13、av-1均升高。DM+HS組p-Akt，p-eNOS最低，Cav-1表達(dá)最高。
　　6.為明確兩者關(guān)系，在HUVEC實(shí)驗(yàn)中，Cav-1 siRNA轉(zhuǎn)染后，Cav-1減少，eNOS表達(dá)卻顯著上升，p-eNOS水平也上升。給予 PI3K抑制劑 wortmannin和NOS阻斷劑L-NAME，eNOS表達(dá)均顯著下降（P<0.01），而Cav-1表達(dá)卻無(wú)明顯下降。該結(jié)果提示，是Cav-1表達(dá)量的改變，進(jìn)而增加了eNOS與Cav-1形成復(fù)合