alpha-dystrobrevin基因在心肌致密化不全中的分子遺傳學探討及轉(zhuǎn)基因動物模型構建.pdf

1、背景：心肌致密化不全（Noncompaction of the Ventricular Myocardium，NVM）是一種遺傳性心肌病，與Tafazzin（TAZ），LIM域結合蛋白3（LIM domain binding3，LDB3），α-dystrobrevin（DTNA），他克莫司結合蛋白1A（FK506 binding protein1A，F(xiàn)KBP1A），核纖層蛋白1B（Lamin1B，LMNB1）及肌節(jié)蛋白基因（Sarcom

2、ere protein genes）等基因異常相關。DTNA位于常染色體18q12，其編碼的蛋白位于心肌和骨骼肌的肌膜上參與細胞骨架結構，即可為心肌等細胞提供結構支持，還參與細胞間的信號轉(zhuǎn)導作用。Notch基因?qū)π呐K發(fā)育起重要作用。在心肌小梁發(fā)育早期發(fā)現(xiàn)存在Notch信號活動。DTNA是否通過與發(fā)育相關的Notch信號通路對早期胚胎骨架形成產(chǎn)生影響？其異常是否會導致NVM這類遺傳性心肌病的發(fā)生。目前這些機制仍然不明。
　　目的：篩

3、查NVM患者DNA標本，尋找相關致病基因及變異。構建攜帶突變基因的轉(zhuǎn)基因動物模型，以發(fā)現(xiàn)突變基因的致病機制及相關信號通路，為將來尋求基因治療新靶點提供理論依據(jù)。
　　方法：對所收集的18例NVM患者DNA標本，以DNA直接測序法篩查候選基因TAZ，LDB3，DTNA，F(xiàn)KBP1和LMN的全部外顯子、外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)，并與100個正常人基因序列比對，尋找基因突變；用DnpI點突變策略將正?；虻腸DNA定點突變，通過顯微注射方法

4、將突變基因注入小鼠受精卵中，構建成攜帶突變基因的轉(zhuǎn)基因小鼠；對轉(zhuǎn)基因小鼠進行Western Blot蛋白印跡觀察、組織細胞學鑒定及心臟超聲及游泳運動負荷實驗等功能檢測。同時，尋找與DTNA基因相關的信號通路。
　　結果：發(fā)現(xiàn)一例患者存在DTNA第4外顯子上的第146位堿基A→G的錯義突變（Asn49Ser，N49S）。經(jīng)過構建α-MyHC-pSK-RSV-m87k（16.1）-DTNA Asn49Ser表達載體，獲得可以將DTNA

5、 Asn49Ser突變基因遺傳給子代并在心肌表達的mDB2/+轉(zhuǎn)基因小鼠品系。mDB2/+小鼠心尖部的左心室壁疏松層可見多小梁結構，致密層（外層）肌纖維排列稀松，心室壁游離面的疏松層與致密層比值比陰性小鼠及野生型小鼠高。4月齡的mDB2/+小鼠左室后壁厚度明顯大于mDB2/-小鼠及野生型小鼠，提示陽性鼠有心室肌壁增厚的改變，但與心室收縮及舒張功能相關的其他指標無明顯變化。8月齡小鼠中的左心室室壁厚度比其他兩組明顯減小，提示左室壁變??；雖

6、然舒張末期的左室直徑及容積和每搏輸出量與其他組相比差異不大，但由于收縮末期左室直徑及容積明顯增大，左室射血分數(shù)及心肌縮短率明顯降低，提示8月齡mDB2/+小鼠心肌收縮功能減退。小鼠游泳運動負荷實驗顯示，4月齡及8月齡小鼠，mDB2/+組，與mDB2/-組及野生型相比，運動耐受時間有減少趨勢，但無統(tǒng)計學差異；12月齡小鼠，mDB2/+組，與與 mDB2/-組及野生型相比，運動耐受時間明顯減少，有顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.01），mDB2/-

7、組與Wildtype組間運動耐受時間無統(tǒng)計學差異。mDB2/+小鼠心肌中Notch1的表達量明顯高于同代同齡陰性及野生型小鼠。
　　結論：DTNA Asn49Ser突變基因是NVM的致病基因；mDB2/+小鼠心尖部的左心室壁疏松層可見多小梁結構，致密層（外層）肌纖維排列稀松，心室壁游離面的疏松層與致密層比值比陰性小鼠及野生型小鼠高，有心肌致密化不全的疾病發(fā)展趨勢。Notch1依賴的信號通路可能參與了與致病基因DTNA相關的心肌致密