嚴(yán)密型四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)的細(xì)胞模型及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立.pdf

1、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是在上世紀(jì)八十年代初發(fā)展起來的一項(xiàng)高新生物技術(shù)。1982年，Palmite等將小鼠金屬硫蛋白(MT-1)基因啟動(dòng)子片段，與大鼠生長激素基因相連接的融合基因轉(zhuǎn)入小鼠受精卵，培育出體重是一般小鼠2倍大的超級(jí)小鼠，引起了世界轟動(dòng)。隨著世界各國普遍開展轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究，轉(zhuǎn)基因技術(shù)也得到了飛速發(fā)展。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在生命科學(xué)研究的重要應(yīng)用從而得以證實(shí)。 與普通的轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，條件轉(zhuǎn)基因技術(shù)使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作有了革新性的發(fā)展，它

2、克服了普通轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一些局限性。例如某些基因在動(dòng)物成體內(nèi)具有致病或毒性作用，采用傳統(tǒng)技術(shù)制作帶有這類基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，由于在胚胎期外源基因就可以表達(dá)，導(dǎo)致動(dòng)物在胚胎時(shí)期發(fā)生死亡而無法進(jìn)行深入研究或者形成免疫耐受，因而作為疾病模型用來探討免疫反應(yīng)及致病機(jī)制顯然不是很理想。可調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控系統(tǒng)基本上都包括三個(gè)組成部分，即調(diào)控部分，攜帶目的基因的反應(yīng)部分和誘導(dǎo)因子部分，其目的是在細(xì)胞或動(dòng)物整體水平實(shí)現(xiàn)對(duì)外源基因表達(dá)的時(shí)空調(diào)控，其中Bu

3、jard和其同事建立的四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)即Tet-off/Tet-on系統(tǒng)是目前較完善的最具代表性的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)之一(GossenandBujardetal，1992；Gossenetal，1995)，目前已成功地用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的研究(Huangetal，2001；Efratetal，1995；Diamondetal，2000)。 四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)的推出為研究基因功能及誘導(dǎo)表達(dá)開辟了一個(gè)嶄新的領(lǐng)域，它為研究系統(tǒng)發(fā)育中基因的調(diào)

4、控表達(dá)和功能、某些特定基因在不同生長過程中的生物學(xué)作用、生化特征提供了理想的研究工具，為基因治療提供了一條可控的安全途徑。然而，其自身存在的一些問題，例如泄漏，使其在應(yīng)用上受到一些限制，特別在某些基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞或胚胎具有毒性或引起免疫耐受時(shí)，當(dāng)需要定時(shí)定量研究基因表達(dá)等情況下，該系統(tǒng)就顯得不夠適合。 為建立嚴(yán)密型四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了帶有肝臟特異性啟動(dòng)子ApoE的rtTA/tTS片段，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染

5、人HepG2細(xì)胞和顯微注射制作ApoE-rtTA-tTS轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。經(jīng)過檢測熒光素酶的活性，獲得了一株低背景表達(dá)和高誘導(dǎo)倍數(shù)的HepG2細(xì)胞克隆。PCR和Southernblot二級(jí)篩選法獲得兩只基因組中整合有ApoE-rtTA-tTS的首建轉(zhuǎn)基因鼠。RT-PCR結(jié)果顯示，rtTA/tTS僅僅在肝臟有特異的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其他組織不表達(dá)。熒光素酶活性檢測結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了tTS對(duì)四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)的內(nèi)在泄露問題有一定的抑制作用，使四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)可以

6、對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行時(shí)間和數(shù)量水平上的有效調(diào)控，使該系統(tǒng)不僅能用于培養(yǎng)細(xì)胞的基因表達(dá)的研究，還可以用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，作為基因功能及基因調(diào)控的主要工具。另外本調(diào)控系統(tǒng)帶有肝臟特異性啟動(dòng)子，能使外源基因在肝臟定點(diǎn)表達(dá)，對(duì)某些肝臟疾病的發(fā)病機(jī)理以及藥物治療的研究均有十分重要的意義。 當(dāng)把本研究建立的帶有調(diào)控部分的模型小鼠，與整合有四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)反應(yīng)部分的小鼠雜交后，可獲得帶有四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)兩種組分的雙轉(zhuǎn)基因小鼠。在特定的時(shí)間內(nèi)通過在飲水中加