大鼠心臟移植模型中mTOR C1-C2信號通路在消除慢性排斥反應(yīng)中的作用.pdf

1、[目的]探索并尋找一種可應(yīng)用于臨床的靶向治療方法，來抑制移植器官的慢性排斥反應(yīng)。
　　盡管臨床器官移植應(yīng)用的免疫抑制劑已經(jīng)取得了令人注目的進(jìn)展，但仍不能逆轉(zhuǎn)慢性排斥反應(yīng)，而這恰恰是移植器官長期存活的關(guān)鍵。因此，目前移植領(lǐng)域相關(guān)研究的一個(gè)重要目標(biāo)就是阻斷慢性排斥，同時(shí)避免全身免疫抑制的副作用。
　　本實(shí)驗(yàn)室建立了大鼠腹腔異位心臟移植模型來研究慢性排斥反應(yīng)阻斷機(jī)制，發(fā)現(xiàn)阻斷慢性排斥是T細(xì)胞浸潤受到顯著抑制，而T細(xì)胞浸潤是細(xì)胞骨架

2、肌動(dòng)蛋白推動(dòng)T細(xì)胞向移植物內(nèi)遷移的過程[1-9]。我們最近的研究顯示阻斷慢性排斥反應(yīng)需要在移植術(shù)后早期（1-7天）實(shí)施阻斷，其導(dǎo)致了細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，而參與構(gòu)建肌動(dòng)蛋白和抗原遞呈細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸?shù)腞ho-GTP酶通路的分子下調(diào)[4，6，7]。這些發(fā)現(xiàn)說明阻斷慢性排斥反應(yīng)需要通過干擾Rho-GTP酶信號通路來破壞T細(xì)胞的細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的完整性和抗原遞呈通路來實(shí)現(xiàn)，而這一研究將開創(chuàng)以Rho-GTP酶信號通路為靶向的免疫抑制

3、治療的新方向。
　　近期的研究顯示哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)(mammalian target ofrapamycin，mTOR)激酶復(fù)合體1和2（雷帕霉素敏感的復(fù)合體1和不敏感度復(fù)合體2）都通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白和RhoA信號通路改變了細(xì)胞的遷移、囊泡運(yùn)輸和膜運(yùn)輸。本實(shí)驗(yàn)中，我們希望通過以大鼠心臟移植為模型，以雷帕霉素敏感的mTOR復(fù)合體1和不敏感度的mTOR復(fù)合體2及下游的靶分子RAC1信號通路的分子成份為研究對象，研究移植術(shù)后早

4、期阻斷慢性排斥反應(yīng)的機(jī)制，并為免疫抑制的臨床研究建立mTOR通路的模型。
　　[方法]
　　1.建立移植模型:成年雄性純系Wistar Furth(WF, RT1.Au)大鼠為供體，ACI(RT1.Aa)大鼠為受體，行腹腔內(nèi)異位心臟移植[1-8]，并分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組:(1)移植后無處理對照組，(2)移植并使用低于治療劑量CsA組（急性排斥反應(yīng)），(3)移植后給予低于治療劑量CsA+同種嵌合的主要組織相容性復(fù)合體（majorhi

5、stocompatibility complex，MHC）1類分子組（本組無急慢性排斥反應(yīng)）。而同種嵌合體多肽[a1h1/u]-RT1.Aa(GenWay, San Diego CA;1mg/Kg)是在移植時(shí)經(jīng)門靜脈注入到受體ACI大鼠的體內(nèi)[1-8]。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組包含5只大鼠。
　　2.T細(xì)胞分離:移植術(shù)后1、3、7天T細(xì)胞自ACI受體大鼠脾臟分離，并使用抗T細(xì)胞磁珠純化[4,6,8]。
　　3.Western blot:用

6、來評估比較慢性排斥反應(yīng)與抑制慢性排斥反應(yīng)狀態(tài)下的目標(biāo)蛋白表達(dá)水平的差異。T細(xì)胞子冰上加入細(xì)胞裂解液(0.15M NaCl，1％脫氧膽酸Na鹽，1％Triton X-100，1％SDS0.01M Tris HC1，pH7.2)并加入蛋白酶抑制劑得到蛋白，Western Blot后，使用mTORC1信號通路抗體:抗mTOR(289KD),-Raptor(149KD),-GBL(36KD),-PRAS40(40KD),-DEPTOR(48KD

7、);mTOR C2信號通路抗體:抗Rictor(200KD)，-mSIN1(59KD)及抗RAC1抗體。蛋白條帶使用Lumi-light Western Blot底物顯影，條帶密度使用Quantity One4.6.1(Biorad)系統(tǒng)分析。
　　4.免疫染色與雙重免疫染色:因mTORC1與C2兩條通路均通過對細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的功能的影響而影響蛋白合成，從而影響T細(xì)胞細(xì)胞的功能。故使用免疫染色及雙重免疫染色的方法研究兩復(fù)

8、合物各成分及下游信號分子在這三種細(xì)胞器的分布及表達(dá)水平，及在慢性排斥組和抑制慢性排斥組的變化。
　　5.將ACI受體大鼠分為三組:陽性對照（接受7劑環(huán)孢素，10mg/kg/d），陰性對照（無處理），試驗(yàn)組（7劑環(huán)孢素，10mg/kg/d+Y-27632），術(shù)后100天取移植心臟標(biāo)本。組織病理和免疫組化:移植物心臟取出后，放入福爾馬林中，制成5μm石蠟組織切片，分別予以HE染色（了解大體形態(tài)）、Trichrome染色（膠原）、Ver

9、hoeff-van Gieson(VVG)染色（血管新生內(nèi)膜）。
　　6..統(tǒng)計(jì)分析:Western Blot結(jié)果使用Sigma plot分析，膠原含量與血管新生內(nèi)膜使用均使用Image-Pro plus分析，膠原含量用膠原面積/（膠原面積+心肌面積）×100％,新生血管內(nèi)膜表示為Neointimal Index(NI)=新生內(nèi)膜面積/（血管腔+新生內(nèi)膜面積）×100％。所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表述，并使用T檢驗(yàn)，P＜0.0

10、5有意義。
　　[結(jié)果]
　　1.心臟異位移植大鼠模型成功建立，術(shù)后可長期存活，急慢性排斥受到抑制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。
　　2.Western Blot結(jié)果顯示使用小劑量CsA+同種嵌合多肽的受體大鼠的移植心臟內(nèi)，mTORC1和C2的部分成分及RAC1表達(dá)均下降，造成mTOR信號通路受到抑制，影響了細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的合成，對T細(xì)胞的繁殖、運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生影響，其對靶器官浸潤減少。
　　3.免疫染色顯示:正常

11、情況下mTOR/Rac1位于細(xì)胞核周內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體中，并均勻分布于胞漿中，在CsA+peptide免疫抑制狀態(tài)下向細(xì)胞膜聚集并呈片狀分布于細(xì)胞膜附近。
　　4.組織病理及免疫組化結(jié)果顯示使用小劑量CsA+Y-27632的受體大鼠的移植心臟內(nèi)，膠原含量較少，而且新生血管內(nèi)膜NI也少于對照組。心肌纖維纖維化程度低，血管閉塞少是心臟慢性排斥反應(yīng)受到抑制的表現(xiàn)。
　　5.術(shù)前口服給予一劑Y-27632(2mg/kg)，結(jié)合小劑量C

12、sA也成功阻斷了慢性排斥反應(yīng)。術(shù)后病理HE染色顯示術(shù)后100天，實(shí)驗(yàn)組對比兩對照組，移植心臟心肌組織內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤明顯少于對照組，纖維化程度也較低，基本保持了心肌正常結(jié)構(gòu)。
　　[結(jié)論]
　　1.大鼠腹腔異位心臟移植模型成功建立，這是下一步研究急慢性排斥反應(yīng)的分子通路機(jī)制的關(guān)鍵。
　　2.試驗(yàn)組不僅RhoA表達(dá)下調(diào)，mTORC1，C2信號通路部分成分及下游RAC1表達(dá)均下調(diào)，在細(xì)胞內(nèi)的分布改變，會(huì)影響T細(xì)胞的細(xì)胞骨架肌