SOCS3在心臟移植慢性排斥反應(yīng)中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、本文分兩個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分：SOCS3基因轉(zhuǎn)染對(duì)小鼠同種異體主動(dòng)脈移植物慢性排斥反應(yīng)的作用和機(jī)制
　　目的：構(gòu)建小鼠同種異體主動(dòng)脈移植模型，模擬人類心臟移植物血管病(cardiac allograft vasculopathy,CAV)病理變化。利用攜帶小鼠細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3(suppressors of cytokine signaling3,SOCS3)基因的重組腺病毒載體全身轉(zhuǎn)染，觀察SOCS3基因?qū)σ?/p>

2、植物慢性排斥反應(yīng)的影響，并探討其機(jī)制。
　　方法：取供體Balb/c小鼠主動(dòng)脈，對(duì)受體C57bl/6小鼠，行同種異體主動(dòng)脈移植。81只C57bl/6小鼠腹主動(dòng)脈移植受體隨機(jī)分為3個(gè)組：1.對(duì)照組，2.Ad-SOCS3組，3.Ad-GFP組。分別于術(shù)后24小時(shí)經(jīng)受體尾靜脈注射100μl無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、1×109pfu編碼SOCS3基因的腺病毒載體和1×109pfu空白腺病毒載體。將每組3只小鼠，分批于轉(zhuǎn)染后第1、3、5

3、、7、14天處死，獲取動(dòng)脈移植物，同時(shí)以正常C57bl/6小鼠主動(dòng)脈作為對(duì)照，采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)SOCS3 mRNA表達(dá)的變化。轉(zhuǎn)染后第3天另取3只小鼠，取動(dòng)脈移植物、肝臟、脾臟、心臟，冰凍切片置于熒光顯微鏡下觀察全身轉(zhuǎn)染效果。每組9只小鼠于術(shù)后第8周處死，獲取動(dòng)脈移植物，用于組織學(xué)檢查、

4、RT-PCR、Western blotting檢測(cè)，獲取脾臟，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。其中RT-PCR和Western blotting檢測(cè)SOCS3、STAT3、IFN-γ、T-bet、IL-10、GATA-3、iNOS、CXCL-10、Arg-1、Fizzl、VCAM-1基因和蛋白表達(dá)；Western blotting檢測(cè)P-STAT3蛋白表達(dá)；動(dòng)脈移植物行組織病理學(xué)切片，HE染色，測(cè)量移植動(dòng)脈狹窄率；CD11b和CD4免疫組織化學(xué)染色

5、，分別計(jì)數(shù)浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟CD4+T-bet+/單核細(xì)胞和CD4+GATA-3+/單核細(xì)胞比率。
　　結(jié)果：1. Ad-SOCS3組，移植物內(nèi)SOCS3 mRNA于轉(zhuǎn)染后第1天即可檢測(cè)到高水平表達(dá)，此后逐漸上升，轉(zhuǎn)染后第5天達(dá)到高峰，之后隨時(shí)間推移逐漸下降，轉(zhuǎn)染后14天仍可檢測(cè)到SOCS3mRNA高表達(dá)。而對(duì)照組及Ad-GFP組移植物內(nèi)SOCS3 mRNA表達(dá)均明顯低于同時(shí)間點(diǎn)Ad-SOCS3組

6、。2.三組移植動(dòng)脈內(nèi)膜均增厚，對(duì)照組和Ad-GFP組移植動(dòng)脈內(nèi)膜增厚更加明顯，管腔面積較Ad-SOCS3組顯著減少，移植動(dòng)脈狹窄率明顯高于Ad-SOCS3組。3.三組小鼠動(dòng)脈移植物均有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Ad-SOCS3組移植動(dòng)脈內(nèi)膜巨噬細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)均較其他兩組明顯減少。4.與對(duì)照組和Ad-GFP組相比，Ad-SOCS3組STAT3、IFN-γ、T-bet、iNOS、CXCL-10、VCAM-1基因和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，P-S

7、TAT3蛋白水平明顯下調(diào)，SOCS3、IL-10、GATA-3、Arg-1、Fizzl基因和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。5.與對(duì)照組和 Ad-GFP組相比，Ad-SOCS3組脾臟CD4+T-bet+/單核細(xì)胞比率明顯降低，CD4+GATA-3+/單核細(xì)胞比率水平明顯升高。
　　結(jié)論：成功建立小鼠同種異體主動(dòng)脈移植模型后，受體小鼠產(chǎn)生對(duì)移植動(dòng)脈的排斥反應(yīng)。利用小鼠SOCS3基因重組腺病毒載體，可有效轉(zhuǎn)染并使受體小鼠動(dòng)脈移植物內(nèi)SOCS3高

8、表達(dá)。SOCS3基因過表達(dá)可抑制受體移植動(dòng)脈內(nèi)膜增生和管腔狹窄，在小鼠同種異體腹主動(dòng)脈移植物慢性排斥反應(yīng)中發(fā)揮保護(hù)性調(diào)節(jié)作用。這一效果可能與抑制JAK/STAT信號(hào)通路激活，調(diào)節(jié)局部及全身免疫反應(yīng)，減少局部巨噬細(xì)胞和CD4+Th細(xì)胞浸潤(rùn)，降低M1型、Th1型促炎性炎癥因子基因和蛋白表達(dá)水平，上調(diào)M2型、Th2型促炎性炎癥因子基因和蛋白表達(dá)水平有關(guān)。其中SOCS3基因?qū)奘杉?xì)胞和CD4+Th細(xì)胞的免疫活性調(diào)節(jié)作用及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

9、r>　　第二部分：SOCS3基因轉(zhuǎn)染對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞和Th細(xì)胞免疫反應(yīng)活性的影響和機(jī)制
　　目的：為了進(jìn)一步研究SOCS3基因?qū)β耘懦夥磻?yīng)中的主要效應(yīng)細(xì)胞——巨噬細(xì)胞和Th細(xì)胞的免疫反應(yīng)活性的影響和機(jī)制，我們?cè)隗w外用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)分別刺激誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞極化、CD4+Th細(xì)胞分化，觀察SOCS3基因轉(zhuǎn)染對(duì)其主要亞群分化和炎癥細(xì)胞因子

10、表達(dá)的影響，并探討其機(jī)制。
　　方法：分別分離并培養(yǎng)C57bl/6小鼠外周血來源巨噬細(xì)胞和脾臟來源CD4+Th細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為3組：對(duì)照組、Ad-SOCS3組和Ad-GFP組，分別以PBS、小鼠SOCS3基因重組腺病毒載體和空白腺病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞。轉(zhuǎn)染成功后，分別以濃度10ng/ml LPS刺激激活小鼠巨噬細(xì)胞24小時(shí)，誘導(dǎo)其極化，以10μg/ml PHA刺激小鼠CD4+Th細(xì)胞48h，誘導(dǎo)其分化。收集細(xì)胞，采用RT-PCR

11、和Western blotting檢測(cè)巨噬細(xì)胞SOCS3、STAT3、iNOS、TNF-α、IL-6、CXCL-10、Arg-1、Fizzl、CCL-22、TGF-β，CD4+Th細(xì)胞SOCS3、T-bet、IL-2、IFN-γ、STAT4、IL-12Rβ2、GATA-3、IL-4、IL-6、IL-10、STAT6基因和蛋白表達(dá)；Western blotting檢測(cè)巨噬細(xì)胞P-STAT3蛋白表達(dá)；免疫熒光技術(shù)(immunofluresc

12、ense assay,IFA)分別檢測(cè)巨噬細(xì)胞iNOS、Arg-1和CD4+Th細(xì)胞IFN-γ、IL-10蛋白表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD86+、CD80+、T-bet+、GATA-3+細(xì)胞亞群百分比。
　　結(jié)果：1.巨噬細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件為：感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=80，轉(zhuǎn)染時(shí)間48小時(shí)。CD4+Th細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件為：MOI=160，轉(zhuǎn)染時(shí)間72小時(shí)。2.Ad-SOCS3組與對(duì)照組

13、和Ad-GFP組相比較，Ad-SOCS3組巨噬細(xì)胞STAT3、iNOS、TNF-α、IL-6、CXCL-10，CD4+Th細(xì)胞T-bet、IL-2、IFN-γ、STAT4、IL-12Rβ2基因和蛋白表達(dá)，以及巨噬細(xì)胞P-STA3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，巨噬細(xì)胞SOCS3、Arg-1、Fizzl、CCL-22、TGF-β，CD4+Th細(xì)胞SOCS3、GATA-3、IL-4、IL-6、IL-10、STAT6基因和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。3.免疫熒光結(jié)果

14、顯示，與對(duì)照組和Ad-GFP組相比較， Ad-SOCS3組巨噬細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，顯色低，而Arg-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，顯色高。CD4+Th細(xì)胞IFN-γ蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，顯色低，而IL-10蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，顯色高。4.Ad-SOCS3組與對(duì)照組和Ad-GFP組相比較，CD86+、T-bet+細(xì)胞亞群百分比減少，CD80+、GATA-3+細(xì)胞亞群百分比增加。
　　結(jié)論：在本實(shí)驗(yàn)中，通過重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染的方式，使小鼠巨

15、噬細(xì)胞和CD4+Th細(xì)胞SOCS3基因過表達(dá)，可在體外刺激誘導(dǎo)分化的過程中，抑制巨噬細(xì)胞M1型極化和Th細(xì)胞Th1型分化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化和Th細(xì)胞Th2型分化。這一結(jié)果與動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。其原因?yàn)镾OCS3基因過表達(dá)通過抑制JAK/STAT信號(hào)通路激活，抑制M1型巨噬細(xì)胞極化、Th1細(xì)胞分化，下調(diào)其炎癥反應(yīng)活性及促炎性細(xì)胞因子表達(dá)。而JAK/STAT信號(hào)通路的競(jìng)爭(zhēng)性抑制和Th1型細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)，可能間接性減弱了對(duì)M2型巨噬