SOCS3在心臟移植慢性排斥反應中的作用和機制研究.pdf

1、本文分兩個部分進行探討：
　　第一部分：SOCS3基因轉(zhuǎn)染對小鼠同種異體主動脈移植物慢性排斥反應的作用和機制
　　目的：構(gòu)建小鼠同種異體主動脈移植模型，模擬人類心臟移植物血管病(cardiac allograft vasculopathy,CAV)病理變化。利用攜帶小鼠細胞因子信號抑制因子3(suppressors of cytokine signaling3,SOCS3)基因的重組腺病毒載體全身轉(zhuǎn)染，觀察SOCS3基因?qū)σ?/p>

2、植物慢性排斥反應的影響，并探討其機制。
　　方法：取供體Balb/c小鼠主動脈，對受體C57bl/6小鼠，行同種異體主動脈移植。81只C57bl/6小鼠腹主動脈移植受體隨機分為3個組：1.對照組，2.Ad-SOCS3組，3.Ad-GFP組。分別于術(shù)后24小時經(jīng)受體尾靜脈注射100μl無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、1×109pfu編碼SOCS3基因的腺病毒載體和1×109pfu空白腺病毒載體。將每組3只小鼠，分批于轉(zhuǎn)染后第1、3、5

3、、7、14天處死，獲取動脈移植物，同時以正常C57bl/6小鼠主動脈作為對照，采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測SOCS3 mRNA表達的變化。轉(zhuǎn)染后第3天另取3只小鼠，取動脈移植物、肝臟、脾臟、心臟，冰凍切片置于熒光顯微鏡下觀察全身轉(zhuǎn)染效果。每組9只小鼠于術(shù)后第8周處死，獲取動脈移植物，用于組織學檢查、

4、RT-PCR、Western blotting檢測，獲取脾臟，用于流式細胞術(shù)檢測。其中RT-PCR和Western blotting檢測SOCS3、STAT3、IFN-γ、T-bet、IL-10、GATA-3、iNOS、CXCL-10、Arg-1、Fizzl、VCAM-1基因和蛋白表達；Western blotting檢測P-STAT3蛋白表達；動脈移植物行組織病理學切片，HE染色，測量移植動脈狹窄率；CD11b和CD4免疫組織化學染色

5、，分別計數(shù)浸潤巨噬細胞和CD4+T淋巴細胞。流式細胞術(shù)檢測脾臟CD4+T-bet+/單核細胞和CD4+GATA-3+/單核細胞比率。
　　結(jié)果：1. Ad-SOCS3組，移植物內(nèi)SOCS3 mRNA于轉(zhuǎn)染后第1天即可檢測到高水平表達，此后逐漸上升，轉(zhuǎn)染后第5天達到高峰，之后隨時間推移逐漸下降，轉(zhuǎn)染后14天仍可檢測到SOCS3mRNA高表達。而對照組及Ad-GFP組移植物內(nèi)SOCS3 mRNA表達均明顯低于同時間點Ad-SOCS3組

6、。2.三組移植動脈內(nèi)膜均增厚，對照組和Ad-GFP組移植動脈內(nèi)膜增厚更加明顯，管腔面積較Ad-SOCS3組顯著減少，移植動脈狹窄率明顯高于Ad-SOCS3組。3.三組小鼠動脈移植物均有炎性細胞浸潤。Ad-SOCS3組移植動脈內(nèi)膜巨噬細胞和CD4+T淋巴細胞數(shù)均較其他兩組明顯減少。4.與對照組和Ad-GFP組相比，Ad-SOCS3組STAT3、IFN-γ、T-bet、iNOS、CXCL-10、VCAM-1基因和蛋白表達水平明顯下調(diào)，P-S

7、TAT3蛋白水平明顯下調(diào)，SOCS3、IL-10、GATA-3、Arg-1、Fizzl基因和蛋白表達水平明顯上調(diào)。5.與對照組和 Ad-GFP組相比，Ad-SOCS3組脾臟CD4+T-bet+/單核細胞比率明顯降低，CD4+GATA-3+/單核細胞比率水平明顯升高。
　　結(jié)論：成功建立小鼠同種異體主動脈移植模型后，受體小鼠產(chǎn)生對移植動脈的排斥反應。利用小鼠SOCS3基因重組腺病毒載體，可有效轉(zhuǎn)染并使受體小鼠動脈移植物內(nèi)SOCS3高

8、表達。SOCS3基因過表達可抑制受體移植動脈內(nèi)膜增生和管腔狹窄，在小鼠同種異體腹主動脈移植物慢性排斥反應中發(fā)揮保護性調(diào)節(jié)作用。這一效果可能與抑制JAK/STAT信號通路激活，調(diào)節(jié)局部及全身免疫反應，減少局部巨噬細胞和CD4+Th細胞浸潤，降低M1型、Th1型促炎性炎癥因子基因和蛋白表達水平，上調(diào)M2型、Th2型促炎性炎癥因子基因和蛋白表達水平有關(guān)。其中SOCS3基因?qū)奘杉毎虲D4+Th細胞的免疫活性調(diào)節(jié)作用及機制有待進一步研究。

9、r>　　第二部分：SOCS3基因轉(zhuǎn)染對小鼠巨噬細胞和Th細胞免疫反應活性的影響和機制
　　目的：為了進一步研究SOCS3基因?qū)β耘懦夥磻械闹饕毎奘杉毎蚑h細胞的免疫反應活性的影響和機制，我們在體外用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)分別刺激誘導小鼠巨噬細胞極化、CD4+Th細胞分化，觀察SOCS3基因轉(zhuǎn)染對其主要亞群分化和炎癥細胞因子

10、表達的影響，并探討其機制。
　　方法：分別分離并培養(yǎng)C57bl/6小鼠外周血來源巨噬細胞和脾臟來源CD4+Th細胞。實驗分為3組：對照組、Ad-SOCS3組和Ad-GFP組，分別以PBS、小鼠SOCS3基因重組腺病毒載體和空白腺病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞。轉(zhuǎn)染成功后，分別以濃度10ng/ml LPS刺激激活小鼠巨噬細胞24小時，誘導其極化，以10μg/ml PHA刺激小鼠CD4+Th細胞48h，誘導其分化。收集細胞，采用RT-PCR

11、和Western blotting檢測巨噬細胞SOCS3、STAT3、iNOS、TNF-α、IL-6、CXCL-10、Arg-1、Fizzl、CCL-22、TGF-β，CD4+Th細胞SOCS3、T-bet、IL-2、IFN-γ、STAT4、IL-12Rβ2、GATA-3、IL-4、IL-6、IL-10、STAT6基因和蛋白表達；Western blotting檢測巨噬細胞P-STAT3蛋白表達；免疫熒光技術(shù)(immunofluresc

12、ense assay,IFA)分別檢測巨噬細胞iNOS、Arg-1和CD4+Th細胞IFN-γ、IL-10蛋白表達；流式細胞術(shù)檢測CD86+、CD80+、T-bet+、GATA-3+細胞亞群百分比。
　　結(jié)果：1.巨噬細胞的最佳轉(zhuǎn)染條件為：感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=80，轉(zhuǎn)染時間48小時。CD4+Th細胞的最佳轉(zhuǎn)染條件為：MOI=160，轉(zhuǎn)染時間72小時。2.Ad-SOCS3組與對照組

13、和Ad-GFP組相比較，Ad-SOCS3組巨噬細胞STAT3、iNOS、TNF-α、IL-6、CXCL-10，CD4+Th細胞T-bet、IL-2、IFN-γ、STAT4、IL-12Rβ2基因和蛋白表達，以及巨噬細胞P-STA3蛋白表達明顯下調(diào)，巨噬細胞SOCS3、Arg-1、Fizzl、CCL-22、TGF-β，CD4+Th細胞SOCS3、GATA-3、IL-4、IL-6、IL-10、STAT6基因和蛋白表達明顯上調(diào)。3.免疫熒光結(jié)果

14、顯示，與對照組和Ad-GFP組相比較， Ad-SOCS3組巨噬細胞iNOS蛋白表達明顯下調(diào)，顯色低，而Arg-1蛋白表達明顯上調(diào)，顯色高。CD4+Th細胞IFN-γ蛋白表達明顯下調(diào)，顯色低，而IL-10蛋白表達明顯上調(diào)，顯色高。4.Ad-SOCS3組與對照組和Ad-GFP組相比較，CD86+、T-bet+細胞亞群百分比減少，CD80+、GATA-3+細胞亞群百分比增加。
　　結(jié)論：在本實驗中，通過重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染的方式，使小鼠巨

15、噬細胞和CD4+Th細胞SOCS3基因過表達，可在體外刺激誘導分化的過程中，抑制巨噬細胞M1型極化和Th細胞Th1型分化，促進巨噬細胞M2型極化和Th細胞Th2型分化。這一結(jié)果與動物模型實驗結(jié)果一致。其原因為SOCS3基因過表達通過抑制JAK/STAT信號通路激活，抑制M1型巨噬細胞極化、Th1細胞分化，下調(diào)其炎癥反應活性及促炎性細胞因子表達。而JAK/STAT信號通路的競爭性抑制和Th1型細胞因子表達下調(diào)，可能間接性減弱了對M2型巨噬