RNAi沉默HIF-2a基因聯(lián)合三氧化二砷對(duì)腎癌細(xì)胞增殖及凋亡提影響.pdf

1、目的:針對(duì)人HIF-2α基因設(shè)計(jì)HIF shRNA干擾序列,然后用真核表達(dá)載體進(jìn)行包裝,轉(zhuǎn)染腎腫瘤Ketr-3細(xì)胞后聯(lián)合AS2O3,觀察其抗腫瘤效應(yīng),最終為提高對(duì)腎臟腫瘤的治療效果開創(chuàng)新的思路并為后期的臨床試驗(yàn)提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.As2O3對(duì)腎癌Ketr-3細(xì)胞增殖及凋亡有效濃度曲線的測(cè)定。將體外培養(yǎng)的人腎癌Ketr-3細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組根據(jù)加入濃度的不同分為A、B、C、D、(1、2、4、

2、6μ mol/L)四組。24、48、72小時(shí)后,CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖活性。
　　 2.人腎癌HIF-2α基因shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建。
　　 3.以脂質(zhì)體為轉(zhuǎn)染載體,將HIF-2α干擾基因轉(zhuǎn)入腎癌Ketr-3細(xì)胞,觀察轉(zhuǎn)染后聯(lián)合As2O3對(duì)腎癌Ketr-3細(xì)胞增殖及凋亡的影響,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性:Annexin V-PI法檢測(cè)細(xì)胞早、晚期凋亡情況。
　　 4.通過Western Blot檢測(cè)As

3、2O3對(duì)腎癌Ketr-3細(xì)胞HIF-2α蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功構(gòu)建As2O3對(duì)腎癌Ketr-3細(xì)胞增殖及凋亡的有效濃度曲線。CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn):與未經(jīng)藥物處理的對(duì)照組比較,經(jīng)不同濃度As2O3處理24-72h后,其生長均受到不同程度抑制,表現(xiàn)為吸光度值(A570)降低。不同濃度之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,不同時(shí)間之間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。As2O3對(duì)腎癌Ketr-3細(xì)胞的增殖抑制作用隨時(shí)間延長和濃度提高

4、而增強(qiáng)。
　　 2.CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),干擾組、藥物組和聯(lián)合治療組對(duì)Ketr-3細(xì)胞的增殖較空白組具有明顯的抑制作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組抑制Ketr-3細(xì)胞增殖的效果比干擾組和藥物組更高,干擾組和藥物組兩者比較無顯著性差異。
　　 3.Annexin V/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示,干擾組、藥物組和聯(lián)合治療組對(duì)Ketr-3細(xì)胞較空白組具有明顯的促進(jìn)其早、晚期凋亡作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組的效果比干擾組和藥

5、物組更高,干擾組和藥物組兩者比較早期凋亡無顯著性差異,干擾組和藥物組兩者比較晚期凋亡存在顯著性差異。
　　 4.Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,將體外培養(yǎng)的人腎癌Ketr-3細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組加入的濃度為2μ mol/L。72小時(shí)后,HIF-2α蛋白的表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無顯著性差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.As2O3能抑制腎癌Ketr-3細(xì)胞的生長,促進(jìn)凋亡,并具有時(shí)間.濃度依賴性。