SiRNA靶向沉默EGFR基因對胰腺癌細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　 構建靶向人EGFR基因的RNAi慢病毒載體并體外轉染人胰腺癌細胞株Panc-1，觀察抑制效果。探討慢病毒介導RNAi沉默EGFR基因在胰腺癌基因治療中的應用前景，以開辟胰腺癌治療的新途徑。
　　 方法：
　　 1．構建慢病毒表達載體LV-shEGFR，陽性克隆測序鑒定。
　　 2．用LV-shEGFR與pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G三種質粒共轉染293T細胞，包裝與純化產

2、生慢病毒顆粒及病毒滴度測定。
　　 3．將獲得的病毒感染胰腺癌細胞株Panc-1細胞，用Real-timePCR及Western-blot檢測細胞中EGFR基因的表達。實驗分為Panc-1組(空白組)、GFP-Panc-1組(對照組)及SiEGFR-Panc-1組(干擾組)共三組。
　　 4．采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測細胞增殖情況，流式細胞儀(FCM)分析細胞周期以及細胞凋亡，探討攜帶目的基因病毒轉染對胰腺癌

3、細胞生物學行為的影響。
　　 結果：
　　 1.LV-shEGFR的克隆測序得到正確的結果，陽性克隆鑒定測序結果如下：CGCAAAGTGTGTAACGGAATA插入片斷位于95-115bp。
　　 2．大量包裝與純化后病毒滴度為2×108TU/ml。
　　 3.Real-timePCR檢測慢病毒感染Panc-1后EGFR基因沉默效果，干擾組抑制率達80％;Westem blot法檢測顯示，干擾組靶細胞EG

4、FR蛋白表達抑制明顯，蛋白條帶明顯變細、變淺，相對表達量顯著下降。
　　 4．干擾組細胞生長速度明顯慢于空白及GFP組細胞，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。三組細胞經過流式細胞儀檢測，干擾組凋亡率為(18.4±2.29)%明顯高于GFP對照組(7.36±1.38)%和空白組(7.72±1.15)%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。干擾組使細胞G2／M期細胞數減少，S期細胞數比例增加差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。