RNAi沉默polβ基因?qū)θ寺殉舶┘?xì)胞增殖活性及對(duì)化療藥物敏感性的影響.pdf

1、背景和目的:
　　 DNA聚合酶β(DNA polymeraseβ,polβ)是聚合酶X家族的一個(gè)成員,不同于聚合酶A、B、Y家族。其主要功能是堿基切除修復(fù)(Base excision repair,BER),在單核苷酸缺口的填補(bǔ)中起重要作用。因?yàn)槠錁O高的錯(cuò)配率,被稱為生物進(jìn)化過(guò)程的“看家酶”。
　　 polβ參與DNA的損傷修復(fù)及跨損傷進(jìn)行DNA合成。正常情況下在體內(nèi)成恒定的低水平表達(dá)?，F(xiàn)已在人類腫瘤組織標(biāo)本中如直腸癌

2、、前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、鼻咽癌、乳腺癌等多種癌中發(fā)現(xiàn)DNA polβ的高表達(dá)。從卵巢正常組織到癌變的過(guò)程中,polβ的表達(dá)量逐漸增加。腫瘤分化程度越低以及臨床分期越高其表達(dá)量愈強(qiáng)。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)是由作用于同源序列mRNA的長(zhǎng)為21—23個(gè)核苷酸的雙鏈RNA所介導(dǎo)的序列特異性、轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。
　　 迄今為止,據(jù)已檢索到的文獻(xiàn)

3、,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)運(yùn)用RNAi技術(shù)阻抑卵巢癌細(xì)胞中polβ基因表達(dá)的相關(guān)研究報(bào)道。因此,課題利用RNAi技術(shù)沉默卵巢癌細(xì)胞中的polβ的表達(dá),觀察polβ抑制后腫瘤細(xì)胞的增殖活性以及對(duì)順鉑敏感性的變化。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 利用已構(gòu)建成功的針對(duì)polβ基因的siRNA(small interfering RNA,siRNA)重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞HO-8910,通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率；同時(shí)設(shè)空載體對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空

4、載體pRNAT-U6.1)和空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染)；熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HO-8910細(xì)胞中polβ mRNA的表達(dá)水平；用MTT法觀察檢測(cè)三個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力變化；臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)法了解各組細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的變化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.已構(gòu)建的靶向polβ基因的siRNA轉(zhuǎn)染HO-8910后,48h后熒光倒置顯微鏡下可見(jiàn)大量綠色熒光顆粒。
　　 2.轉(zhuǎn)染polβ靶siRNA(pRNAT-U6.1-

5、sipolβ)的HO-8910細(xì)胞,DNA聚合酶β基因的mRNA表達(dá)水平明顯降低,與對(duì)照組相比,差別存在高度顯著性(P<0.01)。而轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)siRNA(pRNAT-U6.1)HO-8910細(xì)胞與為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 3.48小時(shí)后結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒sipolβ細(xì)胞的增殖速度較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞明顯減慢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而轉(zhuǎn)染空載體組與正常細(xì)胞組相比,差異無(wú)統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 4.順鉑濃度為2.5-40μg／ml時(shí),轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-sipolβ組的活細(xì)胞數(shù)明顯少于轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1細(xì)胞組和正常細(xì)胞組。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理差異具有高度顯著性(P<0.01),隨著藥物濃度的增加,差別越來(lái)越明顯,且呈濃度依賴性。
　　 結(jié)論:
　　 1.轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pRNAT-U6.1-sipolβ細(xì)胞組、pRNAT-U6.1轉(zhuǎn)染細(xì)胞組及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組經(jīng)RT-PCR檢測(cè)后