RNAi沉默polβ基因對人卵巢癌細胞增殖活性及對化療藥物敏感性的影響.pdf

1、背景和目的:
　　 DNA聚合酶β(DNA polymeraseβ,polβ)是聚合酶X家族的一個成員,不同于聚合酶A、B、Y家族。其主要功能是堿基切除修復(Base excision repair,BER),在單核苷酸缺口的填補中起重要作用。因為其極高的錯配率,被稱為生物進化過程的“看家酶”。
　　 polβ參與DNA的損傷修復及跨損傷進行DNA合成。正常情況下在體內成恒定的低水平表達?，F(xiàn)已在人類腫瘤組織標本中如直腸癌

2、、前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、胰腺癌、結直腸癌、鼻咽癌、乳腺癌等多種癌中發(fā)現(xiàn)DNA polβ的高表達。從卵巢正常組織到癌變的過程中,polβ的表達量逐漸增加。腫瘤分化程度越低以及臨床分期越高其表達量愈強。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術是由作用于同源序列mRNA的長為21—23個核苷酸的雙鏈RNA所介導的序列特異性、轉錄后基因沉默機制。
　　 迄今為止,據(jù)已檢索到的文獻

3、,國內外尚無運用RNAi技術阻抑卵巢癌細胞中polβ基因表達的相關研究報道。因此,課題利用RNAi技術沉默卵巢癌細胞中的polβ的表達,觀察polβ抑制后腫瘤細胞的增殖活性以及對順鉑敏感性的變化。
　　 實驗方法:
　　 利用已構建成功的針對polβ基因的siRNA(small interfering RNA,siRNA)重組質粒,轉染人卵巢癌細胞HO-8910,通過熒光倒置顯微鏡觀察轉染效率；同時設空載體對照組(轉染空

4、載體pRNAT-U6.1)和空白對照組(未轉染)；熒光定量PCR檢測轉染后HO-8910細胞中polβ mRNA的表達水平；用MTT法觀察檢測三個實驗組細胞增殖能力變化；臺盼藍染色細胞計數(shù)法了解各組細胞對順鉑敏感性的變化。
　　 實驗結果:
　　 1.已構建的靶向polβ基因的siRNA轉染HO-8910后,48h后熒光倒置顯微鏡下可見大量綠色熒光顆粒。
　　 2.轉染polβ靶siRNA(pRNAT-U6.1-

5、sipolβ)的HO-8910細胞,DNA聚合酶β基因的mRNA表達水平明顯降低,與對照組相比,差別存在高度顯著性(P<0.01)。而轉染無關siRNA(pRNAT-U6.1)HO-8910細胞與為未轉染細胞組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 3.48小時后結果顯示轉染重組質粒sipolβ細胞的增殖速度較未轉染細胞及轉染空載體的細胞明顯減慢,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而轉染空載體組與正常細胞組相比,差異無統(tǒng)

6、計學意義(P>0.05)。
　　 4.順鉑濃度為2.5-40μg／ml時,轉染pRNAT-U6.1-sipolβ組的活細胞數(shù)明顯少于轉染pRNAT-U6.1細胞組和正常細胞組。經(jīng)統(tǒng)計學處理差異具有高度顯著性(P<0.01),隨著藥物濃度的增加,差別越來越明顯,且呈濃度依賴性。
　　 結論:
　　 1.轉染質粒pRNAT-U6.1-sipolβ細胞組、pRNAT-U6.1轉染細胞組及未轉染細胞組經(jīng)RT-PCR檢測后