中性粒細(xì)胞及相關(guān)信號(hào)通路JAK-STAT在角膜基質(zhì)創(chuàng)傷愈合中的作用.pdf

1、目的： 通過建立小鼠十字形角膜穿通傷的動(dòng)物模型，清除小鼠血循環(huán)中的中性粒細(xì)胞，研究中性粒細(xì)胞對(duì)小鼠十字形角膜穿通傷早期炎癥反應(yīng)及角膜基質(zhì)細(xì)胞活躍性的影響；初步探討炎癥信號(hào)通路JAK-STAT在角膜基質(zhì)損傷早期的作用。 方法： 小鼠角膜十字形角膜穿通傷動(dòng)物模型的建立：選用近交系C57小鼠共170只，按照隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為四組：正常對(duì)照組：11只，不做任何處理；對(duì)照組：72只，單純行十字形角膜穿通傷；中性粒細(xì)胞減

2、少組：27只，小鼠于十字形角膜穿通傷前1天、當(dāng)天、傷后1、2、3連續(xù)腹腔注射大鼠抗小鼠中性粒細(xì)胞單克隆抗體Gr－110ug；AG490組：60只，小鼠于十字形角膜穿通傷前1天、當(dāng)天、傷后1、2、3、5、7天結(jié)膜下注射1ug/ul的AG490混合液20ul。除正常對(duì)照組外，其余三組以20G前房穿刺刀及Vanns剪于角膜中央制作直徑1．2mm十字形穿通傷。采用流式細(xì)胞術(shù)分析中性粒細(xì)胞的清除效率；免疫組化檢測(cè)對(duì)照組傷后1、3、7天p-STAT

3、3、α-SMA的表達(dá)；Western-blot檢測(cè)對(duì)照組及AG490組傷后1、3、5、7天p-STAT3的表達(dá)變化已確定AG490對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路的抑制；裂隙燈顯微鏡觀察各組小鼠傷后1、3、5、7天角膜水腫混濁的情況并進(jìn)行臨床評(píng)分； HE病理切片觀察傷后角膜基質(zhì)中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的情況；電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察傷后3、7天各組小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞及炎癥細(xì)胞活躍程度；Real-time PCR檢測(cè)對(duì)照組及AG490組傷后1、3、5、7、14、2

4、8天及中性粒細(xì)胞減少組傷后1、3、7天IL-6、TNFα、KC、TGFβ mRNA的表達(dá)變化 結(jié)果： 1、以十字型角膜穿通傷建立的小鼠角膜創(chuàng)傷修復(fù)的模型成功率高，損傷范圍適中，可操作性及重復(fù)性較好適合角膜基質(zhì)損傷修復(fù)后續(xù)分子機(jī)制的研究。 2、10ug大鼠抗小鼠Gr-1單克隆抗體腹腔注射可成功清除小鼠血循環(huán)的中性粒細(xì)胞。 3、免疫組化顯示：正常小鼠角膜基質(zhì)中無p-STAT3、α-SMA的表達(dá)；十字形角膜穿通

5、傷后第1天可見p-STAT3的表達(dá)，主要位于角膜基質(zhì)，α-SMA尚未見表達(dá)；傷后3、7天角膜基質(zhì)可見p-STAT3、α-SMA均有陽性著染。 4、Western-blot結(jié)果顯示：正常小鼠角膜p-STAT3有微弱的表達(dá)；十字形角膜穿通傷后5天p-STAT3出現(xiàn)表達(dá)高峰：1ug/ul的AG490混合液20ul結(jié)膜下注射可降低p-STAT3的表達(dá)。 5、裂隙燈顯微鏡觀察：對(duì)照組、中性粒細(xì)胞減少組、AG490組傷后1天傷口閉合

6、，前房形成。對(duì)照組角膜炎癥反應(yīng)最重，傷后3-5天出現(xiàn)炎癥反應(yīng)高峰，角膜水腫混濁范圍>1/2角膜，部分達(dá)全角膜，呈毛玻璃樣混濁，混濁邊緣呈向外擴(kuò)展趨勢(shì)。清除中性粒細(xì)胞角膜水腫混濁明顯減輕，但炎癥高峰后移出現(xiàn)在第7天。AG490結(jié)膜下注射可減輕角膜的炎癥反應(yīng)，但未推遲炎癥反應(yīng)的進(jìn)程，角膜炎癥反應(yīng)程度介于對(duì)照組和中性粒細(xì)胞減少組之間，炎癥高峰出現(xiàn)在3-5天。 6、HE病理切片：對(duì)照組、中性粒細(xì)胞減少組、AG490組，三組傷后1天傷口兩

7、端均有的部分纖維組織聯(lián)結(jié)，封閉傷口，傷后3天均可見傷口全層閉合。對(duì)照組，傷后3-5天明顯增多，浸潤(rùn)范圍較彌散。中性粒細(xì)胞減少組傷后1、3角膜基質(zhì)中未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，傷后7天傷口邊緣可見少許炎癥細(xì)胞。AG490組與中性粒細(xì)胞組相比，并未完全阻斷炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，損傷處仍可見炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，但與對(duì)照組相比角膜基質(zhì)中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯少。 7、電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察：對(duì)照組角膜基質(zhì)中可見活躍的炎癥細(xì)胞，角膜基質(zhì)細(xì)胞明顯增生活躍，可見粗面內(nèi)質(zhì)

8、網(wǎng)及高爾基體豐富，糖原顆粒富集，細(xì)胞突起增多，可見核分裂相；中性粒細(xì)胞減少組未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，角膜基質(zhì)細(xì)胞輕度增生活躍，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基等細(xì)胞器欠發(fā)達(dá)；AG490組角膜基質(zhì)細(xì)胞中度增生活躍，可見核分裂相，未見明顯增多的細(xì)胞突起，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及糖原顆粒輕度增多。偶可見巨噬細(xì)胞游走。 8、Real-time PCR結(jié)果：對(duì)照組傷后1、3、5、7天IL－6、TNFα、KC、TGFβmRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，3-5天出現(xiàn)的表達(dá)高峰，1

9、4天基本降低到正常水平；與對(duì)照相比中性粒細(xì)胞減少組傷后IL-6、TNFα、KC、TGFβ的表達(dá)明顯降低，TNFα、KC的表達(dá)高峰后移出現(xiàn)在第7天。與對(duì)照組相比AG490組IL-6、KC、TGFβ mRNA表達(dá)明顯降低，但對(duì)TNFα表達(dá)影響較小。 結(jié)論： 1．十字型角膜穿通傷可以成功建立小鼠角膜穿通傷模型。 2．中性粒細(xì)胞減少時(shí)，角膜創(chuàng)傷愈合過程的炎癥反應(yīng)明顯減輕，角膜成纖維細(xì)胞的活躍程度降低，但并未影響角膜愈合的