ERK-NF-κB-VEGF信號通路在GMCSF調(diào)控創(chuàng)傷愈合血管新生中的作用.pdf

1、目的：創(chuàng)傷愈合包括炎癥反應、細胞增殖和組織重建三個互相重疊但又具有不同特點的階段。其中炎癥反應是啟動創(chuàng)傷愈合并貫穿于整個過程的關鍵，增殖期則是通過上皮細胞、成纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移來實施創(chuàng)傷的修復。創(chuàng)傷愈合中的新生血管化由創(chuàng)傷后的炎癥介質(zhì)啟動編碼的促血管生成因子作用于血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移而完成，它為創(chuàng)傷部位提供氧、營養(yǎng)和生物活性物質(zhì)，因此對創(chuàng)傷愈合起到了重要作用。課題組在動物實驗中觀察到GMCSF基因剔除小鼠創(chuàng)傷后新生血

2、管的生成減少；在野生型小鼠和新西蘭兔的創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)GMCSF、VEGF與新生血管的形成存在時相性關系；體外實驗進一步發(fā)現(xiàn)了GMCSF通過激活NF-κB誘導VEGF的蛋白質(zhì)合成；在前期試驗也已驗證了GMCSF具有活化NF-κB來誘導VEGF在成纖維細胞內(nèi)的基因表達和蛋白質(zhì)合成的作用，本課題將在前期實驗的基礎上進一步篩選和探討GMCSF下游和NF-k B上游間的信號通路，以期闡明GMCSF調(diào)控創(chuàng)傷愈合中血管新生的分子信號機制。此研究對闡明

3、創(chuàng)傷愈合中新生血管化的細胞和分子生物學機制具有重要的理論創(chuàng)新意義。
　　 方法：⑴體外分離培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞，應用含不同濃度GMCSF的培養(yǎng)液，孵育離體培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞，作用不同時間后，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）) 、蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分別檢測人皮膚成纖維細胞VEGFmRNA表達和蛋白表達。⑵篩選出合適濃度的信號特異性抑制劑預處理成纖維細胞，然后再用GMC

4、SF刺激已預處理過的細胞，收集細胞和上清液，采用ELISA的方法或Western blot檢測VEGF的含量的變化。如VEGF含量降低，提示該抑制的通路可能參與介導GMCSF受體下游的信號轉(zhuǎn)導，然后采用siRNA技術和Western blot技術檢測該信號通路的磷酸化水平來驗證該信號。⑶檢測該通路是否為介導GMCSF活化NF-κB的信號轉(zhuǎn)導途徑。采用研究⑵證實的信號通路抑制劑處理成纖維細胞后，再應用GMCSF處理細胞，通過免疫熒光檢測N

5、F-κB的活化情況來證實該信號是否參與了GMCSF活化NF-κB的信號轉(zhuǎn)導。除此外，采用凝膠電泳遷移技術（EMSA）對NF-κB的激活進行分析，以驗證該信號是否參與了GMCSF活化NF-κB的信號轉(zhuǎn)導。⑷體外實驗驗證GMCSF-ERK-NF-κB-VEGF信號通路在調(diào)控血管新生中的作用:收集方法⑵中的成纖維細胞上清液，處理有劃痕的血管內(nèi)皮細胞及培養(yǎng)在細胞外基質(zhì)上的血管內(nèi)皮細胞，分析其遷移及管腔形成率的變化。
　　 結果：①與空白

6、組比較，隨著GMCSF濃度的增加VEGF表達量也逐步增加，以50 -100 ng/ml濃度最為顯著（P<0.01）；應用50ng/ml的GMCSF作用人皮膚成纖維細胞0、2、4、6、8、12 h后，VEGFmRNA水平于2h開始升高，到4-6h達到峰值，后逐步降低（表達均較對照組顯著增強,p<0．05)。Western blot檢測示：GMCSF作用12h及24h后，與空白組比較VEGF表達明顯增加，以24h為顯著（P<0.05）。EL

7、ISA檢測結果也顯示：與空白組比較，GMCSF作用組VEGF蛋白分泌量顯著增加（P<0.05），并具有一定的時間依賴性。②PD98059能顯著抑制GMCSF誘導人皮膚成纖維細胞VEGF蛋白水平表達的作用，而SB203580、SP600125對GMCSF誘導人皮膚成纖維細胞內(nèi)VEGF蛋白水平的表達無顯著差異（P>0.05）；通過SiRNA干擾ERK信號通路后，與陰性對照比較，轉(zhuǎn)染ERK組其VEGF蛋白表達顯著減少（P<0.05），而陰性組

8、與空白組之間比較，VEGF表達無顯著差異（P>0.05）。另外，GMCSF能夠顯著活化ERK磷酸化過程。③通過應用PD98059抑制ERK信號通路后，免疫熒光顯示：與GMCSF組比較，PD98059+GMCSF組處理的成纖維細胞其NF-κB活化顯著被抑制；另外我們通過EMSA技術也證實，抑制ERK 信號通路后，NF-κB的活化被顯著抑制。④體外血管內(nèi)皮細胞遷移實驗顯示，與空白組比較，GMCSF能顯著促進血管內(nèi)皮細胞的遷移（P<0.05）

9、；而抑制ERK通路或NF-κB后，遷移距離顯著縮短（P<0.05）。體外管腔形成實驗顯示，與空白組比較，GMCSF能顯著促進管腔的形成；而抑制ERK通路或NF-κB后，管腔結構顯著減少（P<0.05）。
　　 結論：⑴GMCSF能夠顯著誘導人皮膚成纖維細胞VEGF的表達，且具有劑量及時間依賴性；⑵GMCSF可經(jīng)ERK信號通路調(diào)控VEGF在成纖維細胞中的表達；⑶GMCSF可經(jīng)ERK信號通路活化NF-κB誘導VEGF在成纖維細胞中表