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文檔簡介
1、目的:創(chuàng)傷愈合包括炎癥反應、細胞增殖和組織重建三個互相重疊但又具有不同特點的階段。其中炎癥反應是啟動創(chuàng)傷愈合并貫穿于整個過程的關鍵,增殖期則是通過上皮細胞、成纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移來實施創(chuàng)傷的修復。創(chuàng)傷愈合中的新生血管化由創(chuàng)傷后的炎癥介質(zhì)啟動編碼的促血管生成因子作用于血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移而完成,它為創(chuàng)傷部位提供氧、營養(yǎng)和生物活性物質(zhì),因此對創(chuàng)傷愈合起到了重要作用。課題組在動物實驗中觀察到GMCSF基因剔除小鼠創(chuàng)傷后新生血
2、管的生成減少;在野生型小鼠和新西蘭兔的創(chuàng)傷模型中發(fā)現(xiàn)GMCSF、VEGF與新生血管的形成存在時相性關系;體外實驗進一步發(fā)現(xiàn)了GMCSF通過激活NF-κB誘導VEGF的蛋白質(zhì)合成;在前期試驗也已驗證了GMCSF具有活化NF-κB來誘導VEGF在成纖維細胞內(nèi)的基因表達和蛋白質(zhì)合成的作用,本課題將在前期實驗的基礎上進一步篩選和探討GMCSF下游和NF-k B上游間的信號通路,以期闡明GMCSF調(diào)控創(chuàng)傷愈合中血管新生的分子信號機制。此研究對闡明
3、創(chuàng)傷愈合中新生血管化的細胞和分子生物學機制具有重要的理論創(chuàng)新意義。
方法:⑴體外分離培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞,應用含不同濃度GMCSF的培養(yǎng)液,孵育離體培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞,作用不同時間后,采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)) 、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分別檢測人皮膚成纖維細胞VEGFmRNA表達和蛋白表達。⑵篩選出合適濃度的信號特異性抑制劑預處理成纖維細胞,然后再用GMC
4、SF刺激已預處理過的細胞,收集細胞和上清液,采用ELISA的方法或Western blot檢測VEGF的含量的變化。如VEGF含量降低,提示該抑制的通路可能參與介導GMCSF受體下游的信號轉(zhuǎn)導,然后采用siRNA技術和Western blot技術檢測該信號通路的磷酸化水平來驗證該信號。⑶檢測該通路是否為介導GMCSF活化NF-κB的信號轉(zhuǎn)導途徑。采用研究⑵證實的信號通路抑制劑處理成纖維細胞后,再應用GMCSF處理細胞,通過免疫熒光檢測N
5、F-κB的活化情況來證實該信號是否參與了GMCSF活化NF-κB的信號轉(zhuǎn)導。除此外,采用凝膠電泳遷移技術(EMSA)對NF-κB的激活進行分析,以驗證該信號是否參與了GMCSF活化NF-κB的信號轉(zhuǎn)導。⑷體外實驗驗證GMCSF-ERK-NF-κB-VEGF信號通路在調(diào)控血管新生中的作用:收集方法⑵中的成纖維細胞上清液,處理有劃痕的血管內(nèi)皮細胞及培養(yǎng)在細胞外基質(zhì)上的血管內(nèi)皮細胞,分析其遷移及管腔形成率的變化。
結果:①與空白
6、組比較,隨著GMCSF濃度的增加VEGF表達量也逐步增加,以50 -100 ng/ml濃度最為顯著(P<0.01);應用50ng/ml的GMCSF作用人皮膚成纖維細胞0、2、4、6、8、12 h后,VEGFmRNA水平于2h開始升高,到4-6h達到峰值,后逐步降低(表達均較對照組顯著增強,p<0.05)。Western blot檢測示:GMCSF作用12h及24h后,與空白組比較VEGF表達明顯增加,以24h為顯著(P<0.05)。EL
7、ISA檢測結果也顯示:與空白組比較,GMCSF作用組VEGF蛋白分泌量顯著增加(P<0.05),并具有一定的時間依賴性。②PD98059能顯著抑制GMCSF誘導人皮膚成纖維細胞VEGF蛋白水平表達的作用,而SB203580、SP600125對GMCSF誘導人皮膚成纖維細胞內(nèi)VEGF蛋白水平的表達無顯著差異(P>0.05);通過SiRNA干擾ERK信號通路后,與陰性對照比較,轉(zhuǎn)染ERK組其VEGF蛋白表達顯著減少(P<0.05),而陰性組
8、與空白組之間比較,VEGF表達無顯著差異(P>0.05)。另外,GMCSF能夠顯著活化ERK磷酸化過程。③通過應用PD98059抑制ERK信號通路后,免疫熒光顯示:與GMCSF組比較,PD98059+GMCSF組處理的成纖維細胞其NF-κB活化顯著被抑制;另外我們通過EMSA技術也證實,抑制ERK 信號通路后,NF-κB的活化被顯著抑制。④體外血管內(nèi)皮細胞遷移實驗顯示,與空白組比較,GMCSF能顯著促進血管內(nèi)皮細胞的遷移(P<0.05)
9、;而抑制ERK通路或NF-κB后,遷移距離顯著縮短(P<0.05)。體外管腔形成實驗顯示,與空白組比較,GMCSF能顯著促進管腔的形成;而抑制ERK通路或NF-κB后,管腔結構顯著減少(P<0.05)。
結論:⑴GMCSF能夠顯著誘導人皮膚成纖維細胞VEGF的表達,且具有劑量及時間依賴性;⑵GMCSF可經(jīng)ERK信號通路調(diào)控VEGF在成纖維細胞中的表達;⑶GMCSF可經(jīng)ERK信號通路活化NF-κB誘導VEGF在成纖維細胞中表
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