枳(Poncirus trifoliata)低溫相關(guān)microRNAs鑒定及ptf-miR396b抗寒功能研究.pdf

1、miRNAs(microRNAs)是普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)的一類內(nèi)源保守非編碼小分子RNA，miRNA和AGO蛋白結(jié)合形成RISC復(fù)合物，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)其靶基因mRNA進(jìn)行剪切或翻譯抑制，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)水平。miRNA參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、開花結(jié)果、衰老、死亡及對(duì)非生物、生物逆境脅迫響應(yīng)等。枳（Poncirus trifoliata）是柑橘近緣屬，抗寒性強(qiáng)，但枳中響應(yīng)低溫的miRNAs卻很少有研究。本研究采用高通量測(cè)序、生物信息

2、學(xué)分析等技術(shù)挖掘枳低溫相關(guān)miRNAs，研究這些miRNAs與其靶基因在枳應(yīng)答低溫脅迫中的功能。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.以低溫4℃馴化3d(CA)和未馴化（Control）的枳葉片進(jìn)行高通量小分子RNA測(cè)序。對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，共鑒定出107個(gè)保守miRNAs，分別屬于44個(gè)miRNA家族，有36個(gè)miRNAs響應(yīng)低溫脅迫，其中14個(gè)miRNAs在其它物種中未見有參與低溫脅迫的報(bào)道。此外，預(yù)測(cè)了5個(gè)新miRNA

3、s。靶基因多數(shù)是轉(zhuǎn)錄因子，實(shí)時(shí)定量驗(yàn)證了miRNAs表達(dá)與測(cè)序結(jié)果一致。
　　2.在柑橘不抗寒類型檸檬中超表達(dá)ptf-miR396b前體基因MIR396b，成熟ptf-miR396b表達(dá)水平在轉(zhuǎn)基因檸檬中大幅提高，且轉(zhuǎn)基因檸檬相比野生型表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗寒性，組織化學(xué)染色和生理指標(biāo)測(cè)定也證實(shí)了轉(zhuǎn)基因檸檬的抗寒性增強(qiáng)。5'-RACE和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化證實(shí)PtrACO是ptf-miR396b的靶基因，兩者在枳響應(yīng)低溫脅迫中具有相反的表

4、達(dá)模式。實(shí)驗(yàn)證明ptf-miR396b上調(diào)抑制PtrACO表達(dá)，進(jìn)而抑制了乙烯合成，同時(shí)多胺合成相關(guān)基因被誘導(dǎo)上調(diào)，多胺含量積累量升高。轉(zhuǎn)基因檸檬低溫處理后，PtrACO表達(dá)水平比野生型更低，乙烯釋放量低于野生型，乙烯和多胺合成的共同底物SAM更多地進(jìn)入多胺合成途徑，多胺合成相關(guān)基因表達(dá)水平及多胺積累量均高于野生型。ptf-miR396b通過調(diào)節(jié)其靶基因PtrACO的表達(dá)水平維持乙烯和多胺合成平衡，從而調(diào)控枳對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)。
　

5、　3.本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新的ptf-miRn02和ptf-miRn04產(chǎn)生于同一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的兩條臂上，且ptf-miRn04的測(cè)序豐度比ptf-miRn02高，ptf-miRn02可能是ptf-miRn04的miRNA*，本章克隆鑒定了枳ptr-miRn04及ptr-miRn02的成熟序列和前體序列，預(yù)測(cè)ptf-miRn04的靶基因是PtrFBA基因，該基因參與糖代謝且與ptr-miRn04的表達(dá)水平呈反向相關(guān)，在煙草中超表達(dá)ptf-mi