類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候分類的系統(tǒng)生物學(xué)基礎(chǔ).pdf

1、本研究首先以類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)為例,利用多元統(tǒng)計(jì)分析方法,分析了臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn):借助因子分析可確定RA的寒熱證候分類,同時(shí)寒熱證候分類與中西藥干預(yù)方法的療效相關(guān),且證候的變化也會(huì)影響療效的改變,說明中醫(yī)寒熱證候分類在RA治療方法的選擇上具有指導(dǎo)價(jià)值。雖然RA寒熱證候分類的依據(jù)主要是中醫(yī)相關(guān)癥狀,但其對(duì)療效的影響說明RA寒熱證候具有特定的生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　 進(jìn)而,以類

2、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為范例,選取臨床典型的RA寒、熱證患者病例,采用系統(tǒng)生物學(xué)思路與方法(基因組學(xué)及代謝組學(xué)),探索RA寒熱證候的內(nèi)在生物學(xué)特征,期望能豐富中醫(yī)證候理論的科學(xué)內(nèi)涵,同時(shí)為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎臨床診斷和有效治療提供理論工具。
　　 1目的
　　 分析RA寒熱證候分類對(duì)中西藥治療方法療效的影響,并通過檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎典型寒、熱證CD4+T淋巴細(xì)胞基因表達(dá)譜及血漿代謝譜,研究寒熱證候的生物學(xué)差異,探討類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候

3、分類的科學(xué)基礎(chǔ)。
　　 2研究對(duì)象和方法
　　 研究思路:利用多元統(tǒng)計(jì)分析方法,分析中西藥治療RA隨機(jī)對(duì)照臨床數(shù)據(jù),探索中醫(yī)寒熱證候分類與療效的關(guān)系；在此基礎(chǔ)上,隨機(jī)選取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的RA女性患者,參照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行寒、熱證候辨別。取患者CD4+T淋巴細(xì)胞及血漿,進(jìn)行基因表達(dá)譜及代謝組學(xué)測(cè)定,尋找類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候之間差異表達(dá)的基因及生物標(biāo)記物,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析,探尋類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候差異的生物學(xué)基礎(chǔ)。<

4、br>　　 3研究?jī)?nèi)容
　　 3.1臨床數(shù)據(jù)分析
　　 數(shù)據(jù)來源:國家“十五”攻關(guān)項(xiàng)目全國9個(gè)臨床中心RA臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 分析方法:采用回歸分析、主成分分析、因子分析、辨別分析、聚類分析等多元統(tǒng)計(jì)方法,探索RA證候分類及各證候類型與臨床療效的相關(guān)關(guān)系。
　　 3.2實(shí)驗(yàn)研究
　　 基因表達(dá)譜研究:隨機(jī)選取北京中日友好醫(yī)院女性患者20例,年齡12-68歲。納入病例中寒證患者為10例,

5、熱證患者為10例。
　　 代謝組學(xué)研究:隨機(jī)選取北京中日友好醫(yī)院女性患者21例,納入病例中寒證患者為15例,熱證患者為6例；另選取16例女性為正常對(duì)照組(依據(jù)體檢結(jié)果排除了感染、炎癥等影響因素)。
　　 ◇病例納入標(biāo)準(zhǔn):疾病診斷、病情進(jìn)展分類標(biāo)準(zhǔn):參照1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ARA)修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　 ◇證候診斷標(biāo)準(zhǔn):參照1993年衛(wèi)生部《中藥新藥治療痹病的臨床研究指導(dǎo)原則》、1994年國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布

6、的《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)·旭痹的診斷依據(jù)、證候分類、療效評(píng)定》、1997年中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《中醫(yī)臨床診療術(shù)語證候部分》和1988年全國中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕類疾病學(xué)術(shù)會(huì)議擬訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　 ◇排除標(biāo)準(zhǔn):合并嚴(yán)重關(guān)節(jié)外表現(xiàn),如高熱不退、多發(fā)類風(fēng)濕結(jié)節(jié)、肺間質(zhì)纖維化、腎臟淀粉樣變、縮窄性心包炎、血管炎等需要使用糖皮質(zhì)激素的患者；長(zhǎng)期服用有關(guān)治療RA的慢作用藥物,且在本研究前至少1周內(nèi)未停用甲氨喋呤、氯喹、柳氮磺胺吡啶、環(huán)磷酰胺、青

7、霉胺和金制劑等免疫抑制類藥物的患者；合并有循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖、造血系統(tǒng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病的患者。
　　 4研究方法
　　 4.1基因表達(dá)譜研究
　　 ◇CD4+T淋巴細(xì)胞分離純化:采集空腹靜脈血,EDTA抗凝,加入CD4+T細(xì)胞富集抗體混勻,Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離,PBS溶液洗兩遍,離心即可得到純度90％以上的CD4+T淋巴細(xì)胞。
　　 ◇芯片雜交前RNA預(yù)處理:按TRIzol說明

8、書,提取細(xì)胞總RNA,并進(jìn)行PNA質(zhì)檢；依據(jù)QIAGEN RNeasy(R)Kit操作手冊(cè)純化總RNA；一步法合成cDNA鏈；aaUTP標(biāo)記合成cRNA；QIAGEN RNeasy Mini Kit純化cRNA并對(duì)其質(zhì)控測(cè)定；cRNA熒光標(biāo)記并純化
　　 ◇芯片雜交及檢測(cè):芯片為Agilent人類全基因組芯片(4*44k),所有芯片均以相同對(duì)照標(biāo)記為Cy3,樣本標(biāo)記為Cy5。cRNA樣品片段化后與芯片雜交,洗滌后Agilent掃

9、描儀掃描得到基因表達(dá)譜原始數(shù)據(jù)。
　　 ◇芯片數(shù)據(jù)分析:分析Agilent軟件導(dǎo)出數(shù)據(jù),取各芯片中位數(shù)比值進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換,然后用SAS的標(biāo)準(zhǔn)化程序進(jìn)行均值為0標(biāo)準(zhǔn)差為1的標(biāo)準(zhǔn)化操作；采用SAS的MI Procedure過程對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行缺失值填補(bǔ)；以alpha=0.05為置信度,對(duì)缺失值填補(bǔ)后的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn),選擇有顯著性差異的基因；采用SAS的Power Procedure對(duì)有顯著性差異的基因過程進(jìn)行把握度計(jì)算,保留Pow

10、er>0.85的基因；以Ratio>2或Ratio<0.5為顯著性差異界限,計(jì)算寒熱證差異基因的比值,篩選寒熱差異表達(dá)基因。借助BIND、DIP、HPRD、IntAct及MINT等數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析；IPCA運(yùn)算法則尋找網(wǎng)絡(luò)高聯(lián)接區(qū)并借助BINGO工具對(duì)高聯(lián)接區(qū)進(jìn)行GO功能分析。
　　 4.2代謝組學(xué)研究
　　 ◇血漿處理:EDTA抗凝管收集外周血,離心取血漿凍存?zhèn)溆谩７治銮俺蜏乇淙〕?充

11、分溶解震蕩,加入乙腈高速離心取上清,加入內(nèi)標(biāo)液充分溶解,離心取上清自動(dòng)取樣器取樣分析。
　　 ◇樣品檢測(cè):自動(dòng)加樣器(Agilent7683系列)加到Agilent6890氣相色譜；色譜柱規(guī)格:30 m×0.25 mm i.d.×0.25μm DB5-MS熔融石英毛細(xì)管柱；噴頭溫度設(shè)定為290℃；載氣:氦氣,35cm/秒；柱溫:起始溫度100℃,以2.5℃/min速率增加至285℃,持續(xù)6 min；傳輸器溫度設(shè)定為285℃；傳輸

12、器溫度設(shè)定為285℃；離子源溫度設(shè)定為200℃；數(shù)據(jù)采集范圍m/z40-500；GC/MS(島津)定性分析。
　　 ◇數(shù)據(jù)分析:數(shù)據(jù)主要采用Par scaling的方法對(duì)所有數(shù)據(jù)集的變量進(jìn)行數(shù)據(jù)尺度同一化處理,采用軟件包(SIMCA-P version11.0)對(duì)原始信息進(jìn)行主成分分析；偏最小二乘法顯著性分析用來找尋能區(qū)分RA寒熱證候貢獻(xiàn)度最大變量。運(yùn)用質(zhì)譜確定最大貢獻(xiàn)度變量的代謝物結(jié)構(gòu),交叉驗(yàn)證測(cè)試用來確認(rèn)PLS-DA模型的可

13、靠性。
　　 5結(jié)果
　　 5.1臨床數(shù)據(jù)分析
　　 ◇西藥方案在治療RA寒熱患者過程中,3個(gè)月及6個(gè)月的療效均以寒證組為高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 ◇在患者證候類型變化的情況下,無論中醫(yī)組及西醫(yī)組方案其臨床療效均發(fā)生顯著性改變。
　　 5.2基因表達(dá)譜
　　 ◇類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候之間有29個(gè)差異基因表達(dá),其中7個(gè)基因在寒證高表達(dá):LPAAT-THETA、COL6A1、ENST0000

14、0256367、THC2318696、SPECC1、TLR4、及THC2312748；22個(gè)基因在熱證高表達(dá):LOC400509、BF210146、CABLES1、APOA1、CD614215、IGHD、SPP1、WWOX等。
　　 ◇利用ICPA運(yùn)算法則查找差異基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)4個(gè)高聯(lián)接區(qū),GO功能分析發(fā)現(xiàn)寒證與toll樣受體信號(hào)通路有關(guān),而鈣離子信號(hào)通路、細(xì)胞粘附分子、PPAR信號(hào)通路以及脂肪酸代謝途徑

15、與熱證相關(guān)聯(lián)。
　　 ◇生物信息學(xué)分析結(jié)果表明:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證患者表現(xiàn)為凋亡及炎癥的不同調(diào)控機(jī)制。
　　 5.3代謝組學(xué)
　　 ◇類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者與正常對(duì)照組、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候之間均存在代謝物譜差異,PLS-DA得分圖顯示RA與正常對(duì)照,RA寒證與熱證之間根據(jù)代謝譜數(shù)據(jù)能夠清晰分開。
　　 ◇PCA、PLS-DA結(jié)合質(zhì)譜方法,找到類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候差異的7個(gè)潛在生物標(biāo)記物:3-氧-丙酸(

16、3.Oxy propanoic acid)、L-脯氨酸(L-Proline)、尿素(Urea)、5-氧-脯氨酸(5-Oxo-proline)、核糖醇(Ribitol)、纖維醇(Inositol)、L-亮氨酸(L-Leucine)。其中前6個(gè)標(biāo)記物為熱證上調(diào),L-亮氨酸為寒證上調(diào)。
　　 ◇對(duì)這些生物標(biāo)記物進(jìn)行功能檢索分析提示:與寒證相比,熱證患者機(jī)體存在過多的膠原分解；而寒證患者機(jī)體蛋白質(zhì)合成過程大于蛋白質(zhì)分解。
　　

17、6結(jié)論
　　 6.1 RA寒熱證候分類與中西藥臨床干預(yù)方案療效相關(guān),且證候的變化也會(huì)影響臨床療效的改變,RA中醫(yī)證候分類在臨床治療方案選擇上具有指導(dǎo)意義。
　　 6.2類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒熱證候存在生物學(xué)差異,應(yīng)用基因表達(dá)譜方法及代謝組學(xué)技術(shù)能夠檢測(cè)出RA寒熱證候差異相關(guān)的基因表達(dá)及生物標(biāo)記物。
　　 6.3生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)RA寒熱證候存在對(duì)凋亡、蛋白質(zhì)代謝等不同的調(diào)控機(jī)制,對(duì)這些機(jī)制的深入了解可幫助理解不同證候臨