C-反應(yīng)蛋白對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響及阿托伐他汀的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景 動(dòng)脈粥樣硬化是一種多因素疾病，年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥等被視為AS的經(jīng)典危險(xiǎn)因素。越來越多的證據(jù)表明，炎癥在AS的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的角色。從最開始的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、泡沫細(xì)胞形成、內(nèi)皮功能障礙、脂質(zhì)條紋及粥樣硬化斑塊出現(xiàn)、乃至最終的冠狀動(dòng)脈事件如急性冠狀動(dòng)脈綜合征的發(fā)生等均和炎癥有著密切關(guān)系。內(nèi)皮是血管的重要保護(hù)屏障，血管內(nèi)皮功能障礙作為AS病理過程中的一個(gè)早期全身性改變，和巨噬細(xì)胞等參與的炎癥反應(yīng)貫

2、穿著AS發(fā)生、發(fā)展的全部過程，是動(dòng)脈粥樣硬化性疾病發(fā)生的核心環(huán)節(jié)，也是該類疾病防治的主要靶點(diǎn)之一。 血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的完整性和功能狀態(tài)與AS發(fā)生、發(fā)展以及血栓事件的發(fā)生密切相關(guān)。血管內(nèi)皮不但是防止巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、泡沫細(xì)胞形成、防止AS發(fā)生的一道重要防線，而且是凝血因子合成、分泌以及調(diào)整凝血功能的重要生理結(jié)構(gòu)。因此，廣義上講血管內(nèi)皮功能除了包含其血管舒張功能外，還包括其調(diào)整凝血功能、抗血栓形成的內(nèi)容。 C—反應(yīng)蛋白是炎癥反應(yīng)的

3、一個(gè)重要標(biāo)志物，同時(shí)也是體內(nèi)重要的促炎癥細(xì)胞因子。許多研究表明，CRP可作為心血管事件的有力預(yù)測(cè)因子。同時(shí)，也不斷有研究證實(shí)CRP不僅可作為炎癥標(biāo)記物和心臟事件的預(yù)測(cè)因子，其本身還能使內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子分泌增加而促進(jìn)炎癥細(xì)胞粘附、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌組織因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等而促進(jìn)凝血和分解細(xì)胞外基質(zhì)，也能使內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞等一氧化氮表達(dá)及分泌降低而內(nèi)皮素-1表達(dá)和分泌增加。因此，許多學(xué)者認(rèn)為CRP本身可能就是促AS的危險(xiǎn)因素，和血管

4、內(nèi)皮功能障礙之間存在著因果關(guān)系。但目前這一領(lǐng)域的研究存在很多爭(zhēng)議，對(duì)CRP在AS和內(nèi)皮功能障礙中究竟是僅僅作為旁觀者角色的標(biāo)記物還是兼有促AS效應(yīng)，目前仍無定論。 本研究擬分三部分對(duì)炎癥及其標(biāo)記物CRP與血管內(nèi)皮功能的關(guān)系及其機(jī)制進(jìn)行初步研究，并探討阿托伐他汀對(duì)其影響。 第一章炎癥對(duì)高脂飲食兔血管內(nèi)皮功能障礙的影響及阿托伐他汀的干預(yù)效應(yīng) 目的：建立新西蘭兔高脂飲食致高脂血癥和血管內(nèi)皮功能障礙模型，并評(píng)價(jià)炎癥在其中

5、的作用和阿托伐他汀的干預(yù)效應(yīng)。 方法：16只新西蘭兔隨機(jī)分為單純高脂飲食組和高脂飲食加阿托伐他汀組，分別測(cè)定總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯、C—反應(yīng)蛋白，白介素—6、一氧化氮、內(nèi)皮素-1、無創(chuàng)超聲評(píng)價(jià)的血管內(nèi)皮功能的基礎(chǔ)水平。8周后再次復(fù)查上述參數(shù)并在A—HF組撤去阿托伐他汀和高脂飲食，分別于撤藥1、4、7天后再次測(cè)定上述參數(shù)。 結(jié)果：8周的高脂飲食可引起明顯的高脂血癥，升高炎癥標(biāo)記物水平，導(dǎo)致ET-1/NO的失

6、衡并引起內(nèi)皮功能障礙。阿托伐他汀治療能顯著改善上述狀況，但并不能將其控制到基線水平。阿托伐他汀撤藥1、4、7天后未能引起明顯的血脂水平變化，但4天和7天后出現(xiàn)明顯的炎癥標(biāo)志物水平明顯升高，并導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙加重，且該效應(yīng)獨(dú)立于血脂水平的變化。 結(jié)論：高脂飲食能引起內(nèi)皮功能障礙，該效應(yīng)與炎癥密切相關(guān)，阿托伐他汀能明顯地反向調(diào)節(jié)該效應(yīng)。阿托伐他汀突然撤藥可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的反彈增強(qiáng)并使內(nèi)皮功能障礙加重，該效應(yīng)獨(dú)立于血脂水平的變化而與炎癥

7、密切相關(guān)。這可能是他汀類撤藥引起心血管事件明顯增加的重要機(jī)理。 第二章 C—反應(yīng)蛋白在血管內(nèi)皮功能障礙中的作用 第一節(jié)重組人CRP和IL—6注射的時(shí)效研究及其對(duì)下丘腦—垂體—腎上腺軸的影響 目的：了解重組人CRP靜脈注射及重組人IL—6皮下注射對(duì)兔血漿CRP濃度的時(shí)間、濃度變化，為下一步研究確定合適劑量和干預(yù)后參數(shù)檢測(cè)時(shí)間。 方法：18只新西蘭兔隨機(jī)分為CRP組和IL—6組2大組，其中每3只又分別按照rh

8、CRP和rhIL—6使用劑量的不同分為3個(gè)亞組。rhCRP的使用劑量分別為0.25、0.5、1.0 mg/kg，rhIL—6的使用劑量分別為0.1、0.4、1.6μg/kg。分別于注射前注射后1h、2h、4h、8h、24h、48h及7days抽取血樣，CRP組檢測(cè)注射后CRP濃度，IL—6組于注射后檢測(cè)IL—6和CRP濃度。同時(shí)，在兩組各時(shí)間點(diǎn)均檢測(cè)血管加壓素、促腎上腺皮質(zhì)激素、皮質(zhì)醇水平以了解rhCRP和rhIL—6注射是否對(duì)下丘腦—

9、垂體—腎上腺軸產(chǎn)生明顯影響。 結(jié)果：rhCRP注射后血漿CRP濃度于1h后到達(dá)峰值并于7天后回落到基線水平。rhIL—6注射后IL—6水平于4h后到達(dá)峰值并于24h后回落到基線水平。而相應(yīng)的CRP水平于rhIL—6注射后24h達(dá)峰，7天后回落到基線水平。各劑量組rhCRP注射均未對(duì)HPA產(chǎn)生明顯影響，0.1和0.4μg/kg的rhIL—6注射也未對(duì)HPA產(chǎn)生明顯影響，而1.6μg/kg的rhIL—6注射致AVP、ACTH及Cor

10、tisol水平明顯上升。 結(jié)論：rhCRP、rhIL—6注射均能使血CRP水平明顯升高，且合適劑量的注射不會(huì)對(duì)HPA產(chǎn)生明顯影響。因此，該法可分別作為外源性和內(nèi)源性升高體內(nèi)CRP濃度的有效方法。 第二節(jié) CRP對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響 目的：探討C—反應(yīng)蛋白對(duì)內(nèi)皮功能的影響，明確其在內(nèi)皮功能障礙中的作用。 方法：實(shí)驗(yàn)用新西蘭兔隨機(jī)分為正常飲食的對(duì)照組和高脂飲食組組。測(cè)定基礎(chǔ)水平的TC、LDL—C、TG、CRP

11、、IL—6、NO、ET-1，并無創(chuàng)超聲評(píng)價(jià)的內(nèi)皮功能，4周后再次測(cè)定上述參數(shù)。再以rhCRP靜脈注射或rhIL—6皮下注射以升高體內(nèi)CRP濃度。因上述預(yù)試驗(yàn)證實(shí)rhCRP注射后2h以及rhIL—6注射后24h時(shí)血漿CRP濃度接近峰值，故分別于rhCRP注射后2h和rhIL—6注射后24h再次測(cè)定上述參數(shù)。 結(jié)果：4周的高脂飲食可致明顯的高脂血癥、升高炎癥標(biāo)記物水平，并出現(xiàn)明顯的內(nèi)皮功能障礙。不管是內(nèi)源性還是外源性途徑使CRP水平

12、明顯升高，均可使高脂血癥所致的內(nèi)皮功能障礙進(jìn)一步加重而對(duì)無內(nèi)皮功能障礙的非高脂血癥兔的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能無明顯影響。 結(jié)論：CRP能進(jìn)一步惡化高脂血癥誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙，但對(duì)無內(nèi)皮功能障礙兔的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能無明顯影響。因此，CRP對(duì)血管內(nèi)皮功能的直接影響主要取決于內(nèi)皮功能狀態(tài)本身。 第三章 CRP對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TF/TFPI及PAI-1表達(dá)與活性的影響及阿托伐他汀的調(diào)節(jié)效應(yīng) 第一節(jié) CRP對(duì)人

13、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TF/TFPI及PAI-1表達(dá)及活性的影響及其機(jī)制探討 目的：了解CRP對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC) TF、TFPI、PAI-1表達(dá)及其活性的影響。 方法：HUVEC細(xì)胞株復(fù)蘇后穩(wěn)定傳4代后作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色法觀察細(xì)胞活力，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定TF、FTPI、PAI-1抗原的表達(dá)，real—time RT—PCR檢測(cè)TF、TFPI、PAI-1的mRNA表達(dá)，Westernblot檢測(cè)

14、酸化的IκB—α(P—IκB—α)蛋白水平，以發(fā)色底物法測(cè)定TF、TFPI、PAI-1活性，電泳遷移率轉(zhuǎn)變?cè)囼?yàn)(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)檢測(cè)核因子—κB(NF—κB)活性。 結(jié)果：各濃度CRP對(duì)HUVEC細(xì)胞活力無明顯影響；CRP呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性地促進(jìn)TF及PAI-1抗原表達(dá)，抑制TFPI抗原表達(dá)，使TF及PAI-1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)而使TFPI mRNA表達(dá)降

15、低；CRP使TF、PAI-1活性增加，而使TFPI活性降低；CRP使P—IκB—α蛋白表達(dá)明顯上升，并使NF—κB活性增強(qiáng)。NF—κB抑制劑PDTC干預(yù)可使CRP介導(dǎo)的TF、PAI-1基因及抗原表達(dá)及活性明顯減弱，使TFPI基因及抗原表達(dá)及活性明顯增強(qiáng)。 結(jié)論：CRP通過IκB/NF—κB通路在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上劑量、時(shí)間依賴地使HUVEC細(xì)胞TF和PAI-1表達(dá)增強(qiáng)，并提高TF、PAI-1活性，降低TFPI表達(dá)及活性。

16、第二節(jié)阿托伐他汀對(duì)CRP誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞TF/TFPI和PAI-1表達(dá)及活性的影響及其機(jī)制探討 目的：觀察阿托伐他汀對(duì)CRP誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞TF、TFPI、PAI-1表達(dá)及活性的影響并探討其機(jī)制。 方法：HUVEC細(xì)胞株復(fù)蘇后穩(wěn)定傳4代后作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色法觀察細(xì)胞活力，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定TF、FTPI、PAI-1抗原的表達(dá)，real—time RT—PCR檢測(cè)TF、TFPI、PAI-1的mRN

17、A表達(dá)，Westernblot檢測(cè)磷酸化的IκB—α(P—IκB—α)、磷酸化的NF—κB—p65(P—NF—κB—p65)，Akt(P—Akt)蛋白表達(dá)水平，以發(fā)色底物法測(cè)定TF、TFPI、PAI-1活性，EMSA法測(cè)定NF—κB活性。 結(jié)果：阿托伐他汀能明顯反向調(diào)控CRP干預(yù)的HUVEC細(xì)胞TF、TFPI、PAI-1的mRNA、抗原表達(dá)及活性。阿托伐他汀劑量依賴性地抑制CRP干預(yù)的HUVEC細(xì)胞NF—κB活性，但未能明顯降低