烏梢蛇Ⅱ型膠原蛋白提取和純化及對(duì)AA大鼠干預(yù)作用的研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以滑膜異常增生為病理特點(diǎn)的一種自身免疫病。RA是一種難治性疾病，無(wú)論是使疾病完全緩解、基本緩解、還是減輕疾病的活動(dòng)程度，均需要長(zhǎng)期用藥。但至今尚未發(fā)現(xiàn)一種藥物（包括甲氨喋呤、金制劑等疾病控制藥物）能夠完全控制病情。國(guó)內(nèi)外研究者試圖以各種聯(lián)合用藥方案來(lái)控制病情發(fā)展，曾有過(guò)“金字塔”方案，采用所謂上臺(tái)階式，即先用消炎止痛藥，半年后無(wú)效再逐一增加改變病情的抗風(fēng)濕藥，如金制劑、青霉

2、胺，無(wú)效再加細(xì)胞毒藥物，最后用激素。但這種方式的最大缺點(diǎn)是使用消炎止痛藥半年無(wú)效，骨質(zhì)已被破壞，再用改變病情藥物，對(duì)已存在的關(guān)節(jié)破壞無(wú)法恢復(fù)。另一種是下臺(tái)階模式，即先聯(lián)合用藥，以后逐漸減停，最后僅留一兩種副作用最小的藥物維持，但是究竟那種方案才是最好的選擇，聯(lián)合用藥后的遠(yuǎn)期療效如何，尚無(wú)人能肯定做出答復(fù)。并且無(wú)論哪種用藥方式均無(wú)法避免病情控制藥物的非特異性抑制全身免疫系統(tǒng)所帶來(lái)的副作用。生物制劑目前已經(jīng)開始在國(guó)內(nèi)逐步廣泛應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外均有

3、其關(guān)于迅速抑制炎癥和改善RA骨質(zhì)破壞的報(bào)道，但因其長(zhǎng)期療效觀察的研究較少，增加意料之外的感染風(fēng)險(xiǎn)，價(jià)格昂貴，而限制了其臨床的廣泛應(yīng)用。目前對(duì)RA發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在抗原模糊識(shí)別研究方面，針對(duì)其發(fā)病機(jī)制，如果能抑制T細(xì)胞針對(duì)自身抗原的免疫反應(yīng)，恢復(fù)機(jī)體對(duì)暴露的自身抗原耐受，有利于治療自身免疫疾病。 口服耐受（Oral tolerance，OT）指口服引起自身免疫病的蛋白類自身抗原，誘導(dǎo)相關(guān)免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子活化，抑制體內(nèi)針對(duì)自

4、身抗原的免疫反應(yīng)，達(dá)到治療自身免疫疾病的目的。這一安全有效方便的治療方法逐漸受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。因此近20年來(lái)，OT已經(jīng)成為免疫治療中的一個(gè)熱點(diǎn)。OT的基本機(jī)制涉及主動(dòng)抑制（active suppression）、旁路抑制（bystander suppression）、克隆缺失（clonal deletion）、克隆無(wú)能（clonal anergy）、TGF-β等抑制性炎癥因子的分泌以及Th1細(xì)胞因子和Th2細(xì)胞因子之間的平衡。哪種方

5、式在口服耐受中起支配作用在很大程度上取決于口服抗原的劑量和種類以及自身的免疫狀態(tài)。低劑量介導(dǎo)主動(dòng)抑制和旁路抑制，而高劑量介導(dǎo)克隆無(wú)能或缺失。近年來(lái)，口服免疫耐受已成為黏膜免疫的研究熱點(diǎn)，并廣泛用于變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓膜炎、RA、Ⅰ型糖尿病、自身免疫性甲狀腺炎、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力等自身免疫疾病的研究當(dāng)中。國(guó)內(nèi)外均有關(guān)于口服抗原治療自身免疫疾病的臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)報(bào)道。 Ⅱ型膠原蛋白（typeⅡ collagen，CII）是人和動(dòng)物

6、關(guān)節(jié)中含量最豐富的蛋白之一，被認(rèn)為最有可能是RA的自身抗原。各物種的膠原蛋白具有高度同源性，90%左右的氨基酸序列相同。目前國(guó)內(nèi)外均有通過(guò)口服CII誘導(dǎo)免疫耐受治療RA動(dòng)物模型的研究報(bào)道，該方法簡(jiǎn)便、安全、有效，是目前研究的熱點(diǎn)。烏梢蛇是治療關(guān)節(jié)疼痛的常用中藥，烏梢蛇水煎液主要成分分析顯示其含有大量的膠原物質(zhì)。佐劑誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）在臨床表現(xiàn)、病理學(xué)、免疫學(xué)改變和病理機(jī)制等方面與人RA有許多相似特

7、征，目前較為廣泛和成熟的應(yīng)用于RA的臨床和基礎(chǔ)研究中。提取烏梢蛇有效成分，并對(duì)其AA大鼠的干預(yù)作用機(jī)制進(jìn)行初步研究，有助于我們認(rèn)識(shí)烏梢蛇治療RA的機(jī)制。 目的: 1.提取和純化烏梢蛇CII。 2.通過(guò)觀察烏梢蛇CII對(duì)佐劑誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型的干預(yù)作用的研究，對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探索。 方法: 1烏梢蛇CII的提取和鑒定 1．1,采取限制性胃蛋白酶降解法提取烏梢蛇CII； 1．2, S

8、DS-PAGE凝膠電泳測(cè)定提取烏梢蛇CII的蛋白分子量； 1．3,紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取烏梢蛇CII的紫外吸收波長(zhǎng)； 1．4, western-blot方法鑒定提取的烏梢蛇cn； 2.烏梢蛇CII對(duì)AA大鼠的干預(yù)作用的研究 2．1,采用完全弗氏佐劑（complete Freud's adjuvant，CFA）0．1ml足墊皮下注射誘導(dǎo)AA大鼠模型； 2．2,實(shí)驗(yàn)分組：烏梢蛇CII體外直接作用濃度方

9、案：空白對(duì)照組（Control）、烏梢蛇cn低劑量組（low doses，LD）、烏梢蛇CII中劑量組（middle doses，MD）、烏梢蛇CII高劑量組（high doses，HD）分別為CII0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml；灌服烏梢蛇CII濃度方案：烏梢蛇CII低劑量組（low doses，LD）、烏梢蛇CII中劑量組（middle doses，MD）、烏梢蛇CII高劑量組（high doses，H

10、D）、分別灌服CII5μg/kg、50μg/kg、500μg/kg；正常大鼠組、AA模型組灌服0．01 mol/L的冰醋酸（即CII的溶劑）； 2．3,分別以高、中、低劑量CII灌服SD大鼠模型，并設(shè)空白對(duì)照組和AA模型組；造模后16天、20天、24天、28天觀察腫脹關(guān)節(jié)，造模后28天分離滑膜、切片HE染色，觀察滑膜炎癥； 2．4, L929細(xì)胞毒性法檢測(cè)TNF-α細(xì)胞毒活性，MTT法檢測(cè)IL-1β細(xì)胞增殖活性；

11、 2．5, ELISA法檢測(cè)血清和滑膜細(xì)胞上清液的細(xì)胞因子水平； 3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：結(jié)果均用mean±SD表示，采用SPSS13．0軟件進(jìn)行分析，關(guān)節(jié)腫脹度評(píng)分采用重復(fù)測(cè)量方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，多組間比較采用one-wayANOVA方差分析法，方差齊時(shí)，兩組比較采用LSD檢驗(yàn)，如多組與對(duì)照組比較使用Dnutte檢驗(yàn)，當(dāng)方差不齊時(shí)，采用Welch穩(wěn)健估計(jì)，再采用T2方法兩兩比較，P<0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1

12、.烏梢蛇CII的鑒定。 1．1,SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定的烏梢蛇CII分子量約為118KD～120kD； 1．2,紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的CII吸收峰約為230nm； 1．3, western-blot測(cè)定其顯影帶均與標(biāo)準(zhǔn)的牛鼻中隔CII相符； 2.烏梢蛇CII對(duì)AA大鼠的干預(yù)作用的研究 2．1,采用完全弗氏佐劑足厚墊下注射誘導(dǎo)佐劑型關(guān)節(jié)炎模型，至免疫后15d左右開始出現(xiàn)對(duì)側(cè)關(guān)節(jié)腫脹，后肢、踝

13、關(guān)節(jié)及足部小關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫，逐漸加重，嚴(yán)重者呈現(xiàn)消瘦、脫毛、尾部腫脹等全身表現(xiàn)。 2．2,灌服烏梢蛇CII對(duì)AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度的影響：造模后16、20天各組關(guān)節(jié)腫脹程度無(wú)顯著性差異，造模后24天、28天，中、低劑量CII組動(dòng)物模型關(guān)節(jié)腫脹程度得到改善（P<0．05）； 2．3,烏梢蛇CII體外對(duì)AA大鼠滑膜細(xì)胞炎癥因子活性的影響：烏梢蛇CII各濃度組體外對(duì)AA大鼠滑膜細(xì)胞上清液TNF-α和IL-1β活性沒(méi)有直接作用；

14、 2．4,烏梢蛇CII體外對(duì)AA大鼠滑膜細(xì)胞和腸集合淋巴小結(jié)（Peyer's patch，PP）細(xì)胞共培體系的炎癥因子活性的影響：烏梢蛇CII中濃度組可抑制AA大鼠的滑膜細(xì)胞和PP共培體系上清液TNF-α和IL-1β活性（P<0．01），烏梢蛇CII低、高濃度組可抑制AA大鼠的滑膜細(xì)胞和PP共培體系上清液IL-1β活性（P<0．05）； 2．5,灌服烏梢蛇CII對(duì)AA大鼠滑膜細(xì)胞炎癥因子活性的影響：AA模型組與空白對(duì)照組相比

15、，滑膜上清液TNF-α和IL-1β活性顯著升高（P<0．01）；灌服烏梢蛇cII低、中劑量組與AA模型組相比，TNF-α活性下降（P<0．05）；中劑量組與AA模型組相比，IL-1β活性下降（P<0．05）； 2．6,灌服烏梢蛇CII對(duì)AA大鼠滑膜細(xì)胞上清液炎癥因子水平的影響：AA模型組與空白對(duì)照組相比，滑膜上清液TNF-α和IL-1β水平顯著升高（P<0．01）；烏梢蛇CII中、高劑量作用組與AA模型組相比，均能抑制滑膜上清液

16、TNF-α和IL-1β水平（P<0．01）；烏梢蛇CII低劑量組能顯著抑制滑膜上清液IL-1β水平（P<0．01）；烏梢蛇CII中劑量組能顯著升高滑膜上清液TGF-β（P<0．01）； 2．7,灌服烏梢蛇CII對(duì)AA大鼠血清炎癥因子水平的影響：AA模型組與空白對(duì)照組相比，TNF-α濃度升高（P<0．01）、IL-1β濃度顯著升高（P<0．01）；灌服烏梢蛇CII中、高劑量組與AA模型組相比，TNF-α濃度下降（P<0．01）；灌

17、服烏梢蛇CII各劑量組與AA模型組相比，IL-1β濃度顯著下降（P<0．01）；灌服烏梢蛇CII中、高劑量組與AA模型組相比，TGF-β濃度上升（P<0．01）； 結(jié)論: 1.采用限制性胃蛋白酶降解法提取烏梢蛇CII，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、紫外分光光度計(jì)法和western-blot法鑒定理化性質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)的CII一致，證明我們提取的為烏梢蛇CII。 2.灌服烏梢蛇CII能改善AA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度和滑膜炎癥、烏梢