胸腺素β4對循環(huán)內皮祖細胞的作用及機制.pdf

1、血管內皮損傷在心血管疾病中的重要性已被廣泛認同。成熟內皮細胞能夠修復損傷內皮，但是其再生能力有限。因此越來越多的科學研究者關注內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在血管修復、重構和血管新生中的作用。盡管目前對于EPCs的確切來源和功能定義仍存有爭議，但大量新興研究表明，EPCs在缺血組織的血管新生、內皮損傷的修復等方面扮演重要角色，然而，多種心血管疾病或心血管疾病危險因素諸如老齡、高血壓、高膽

2、固醇血癥、吸煙、糖尿病等會使循環(huán)EPCs的功能受損，從而限制了基于EPCs的細胞治療手段在臨床中的應用。既然異體輸注健康人捐獻的EPCs要面臨免疫排斥問題，因此我們有理由相信功能修飾(如促進EPCs動員、歸巢、存活或分泌保護性生長因子等)自體EPCs可能是將來EPCs-細胞治療心血管疾病的重要策略。胸腺素β4(thymosinβ4，Tβ4)，一種由43個氨基酸殘基組成的小分子量蛋白，廣泛分布于人體內多種組織與細胞中。Tβ4介導了多種生物

3、學反應，如血管新生、創(chuàng)傷愈合等。此前研究表明，Tβ4能增強多種干/祖細胞的增殖、遷移、分化等功能，進而促進血管新生及心肌修復。但是，目前國內外尚缺乏Tβ4對循環(huán)EPCs的作用及機制的系統(tǒng)研究。我們近期研究發(fā)現Tβ4能夠通過激活PI3K/Akt/eNOS信號通路促進EPCs遷移，但是Tβ4對于EPCs凋亡、增殖、衰老等功能的影響仍有待進一步研究。基于上述考慮，我們提出假設：Tβ4能增強循環(huán)EPCs的功能，促進血管內皮損傷的修復，維持血管內

4、皮的完整性，從而增強循環(huán)EPCs的心血管保護作用。由于目前國內外對Tβ4影響EPCs的功能及其機制方面的研究甚少，我們首先觀察了Tβ4對EPCs活性、增殖、粘附、集落形成和衰老等功能的影響；其次我們研究了Tβ4對EPCs凋亡的作用，并探討了可能參與其中的信號轉導機制；最后我們還觀察了Tβ4對EPCs旁分泌作用的影響。以下分三部分對本研究的方法、結果及結論作一簡述。
　　 第一部分：胸腺素β4對循環(huán)內皮祖細胞功能的影響。
　

5、　 目的：觀察外源性Tβ4體外干預對循環(huán)EPCs功能的影響。
　　 方法：采用密度梯度離心法從健康人外周血獲取單個核細胞，接種于人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)7d后，采用激光共聚焦顯微鏡檢測FITC-UEA-I及DiI-acLDL雙染色鑒定EPCs，采用流式細胞儀檢測其表面標志(VEGFR-2，CD34，CD133)，進一步鑒定EPCs。加入不同濃度Tβ4(1、10、100和1000ng/mL)干預不同時間后。分別采用MTT

6、比色法、Brdu細胞增殖試劑盒、粘附能力測定、集落形成實驗實驗和SA-β-半乳糖苷酶染色試劑盒觀察EPCs的活性、增殖、粘附、集落形成和衰老。
　　 結果：Tβ4呈濃度依賴地增加EPCs的活性、增殖、集落形成和粘附能力，在1000ng/mL組達到最大效應(與對照組比較，細胞活性0.410±0.052vs0.264±0.035，P<0.05；增殖能力0.802±0.081 vs0.593±0.042，P<0.05；粘附能力44.4

7、±3.4 vs17.8±4.3，P<0.05；集落形成能力17.3±3.1 vs5.7±2.1，P<0.05)。此外，Tβ4干預還顯著抑制EPCs的衰老，且呈一定的量效關系，在1000ng/mL時達到最大效應(與對照組比較，20.67±3.06％vs45.33±3.51％，P<0.05)。
　　 結論：Tβ4可增強EPCs的細胞活性、增殖和粘附等功能，同時抑制EPCs的衰老，且Tβ4對EPCs功能的作用具有一定的濃度依賴性。

8、r>　　 第二部分：胸腺素β4對循環(huán)內皮祖細胞凋亡的作用及機制。
　　 目的：觀察Tβ4對循環(huán)EPCs凋亡的作用并探討其信號轉導機制。
　　 方法：從健康人外周血分離、培養(yǎng)循環(huán)EPCs。細胞培養(yǎng)至7d后，采用去血清培養(yǎng)48h以誘導EPCs凋亡。加入不同濃度的Tβ4處理后，western blot檢測EPCsAkt/p-Akt Ser473、eNOS/p-eNOS Ser1177、PTEN/PTEN Ser380、JNK

9、/p-JNK、P38/p-P38和ERK1/2/p-ERK1/2等信號通路蛋白以及凋亡相關蛋白caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2和細胞色素C等凋亡相關蛋白的表達。隨后，在分別加入磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)抑制劑、內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抑制劑、c-jun氨基末端激酶(c-junN-

10、terminal kinase，JNK)抑制劑等各種信號通路抑制劑預處理EPCs30min后，再予以1000ng/mL Tβ4干預24h，采用Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒檢測EPCs的凋亡率。
　　 結果：Tβ4干預顯著抑制去血清誘導的EPCs凋亡和胞漿細胞色素C水平，且呈濃度依賴性。PI3K抑制(LY294002和Wortmannin)或JNK抑制劑SP600125能夠拮抗Tβ4的抗凋亡作用。此外，Tβ4還抑制了ca

11、spase-3、caspase-9的表達和活性，同時上調Bcl-2/Bax比值。Tβ4能夠在EPCs能與ILK形成免疫復合物，增加ILK的活性而不影響其表達。ILK-siRNA轉染后完全抑制Tβ4對ILK-Akt的激活，從而最終拮抗了Tβ4對EPCs凋亡的作用。
　　 結論：Tβ4抑制去血清誘導的EPCs凋亡與ILK-Akt的激活有關，此外，JNK MAPK也可能參與了Tβ4對EPCs凋亡作用的調節(jié)。
　　 第三部分：胸

12、腺素β4對循環(huán)內皮祖細胞旁分泌作用的影響。
　　 目的：觀察Tβ4對循環(huán)EPCs旁分泌作用的影響。
　　 方法：從健康人外周血分離、培養(yǎng)循環(huán)EPCs。EPCs條件培養(yǎng)液(EPCs-derivedconditioned medium，EPCs-CM)是循環(huán)EPCs用不含血清的EBM-2培養(yǎng)24h獲得。采用Ki-67免疫熒光檢測、Trans-well細胞遷移檢測和Martigel膠毛細血管樣結構形成分別檢測臍靜脈內皮細胞(H

13、uman umbilical vein endothelial cells，HUVECs)體外增殖、遷移和血管形成能力。熒光定量PCR檢測EPCs內VEGF、SDF-1、IGF-1、HGF-1、FGF-2、Tβ4和IL-8的表達。
　　 結果：EPCs-CM能夠顯著增強內皮細胞增殖、遷移和毛細血管樣結構形成能力。Tβ4干預能夠進一步增強EPCs-CM對內皮細胞功能的影響。此外，Tβ4干預增加EPCs內VEGF、FGF-2、IL-