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文檔簡介
1、血管內皮損傷在心血管疾病中的重要性已被廣泛認同。成熟內皮細胞能夠修復損傷內皮,但是其再生能力有限。因此越來越多的科學研究者關注內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)在血管修復、重構和血管新生中的作用。盡管目前對于EPCs的確切來源和功能定義仍存有爭議,但大量新興研究表明,EPCs在缺血組織的血管新生、內皮損傷的修復等方面扮演重要角色,然而,多種心血管疾病或心血管疾病危險因素諸如老齡、高血壓、高膽
2、固醇血癥、吸煙、糖尿病等會使循環(huán)EPCs的功能受損,從而限制了基于EPCs的細胞治療手段在臨床中的應用。既然異體輸注健康人捐獻的EPCs要面臨免疫排斥問題,因此我們有理由相信功能修飾(如促進EPCs動員、歸巢、存活或分泌保護性生長因子等)自體EPCs可能是將來EPCs-細胞治療心血管疾病的重要策略。胸腺素β4(thymosinβ4,Tβ4),一種由43個氨基酸殘基組成的小分子量蛋白,廣泛分布于人體內多種組織與細胞中。Tβ4介導了多種生物
3、學反應,如血管新生、創(chuàng)傷愈合等。此前研究表明,Tβ4能增強多種干/祖細胞的增殖、遷移、分化等功能,進而促進血管新生及心肌修復。但是,目前國內外尚缺乏Tβ4對循環(huán)EPCs的作用及機制的系統(tǒng)研究。我們近期研究發(fā)現Tβ4能夠通過激活PI3K/Akt/eNOS信號通路促進EPCs遷移,但是Tβ4對于EPCs凋亡、增殖、衰老等功能的影響仍有待進一步研究。基于上述考慮,我們提出假設:Tβ4能增強循環(huán)EPCs的功能,促進血管內皮損傷的修復,維持血管內
4、皮的完整性,從而增強循環(huán)EPCs的心血管保護作用。由于目前國內外對Tβ4影響EPCs的功能及其機制方面的研究甚少,我們首先觀察了Tβ4對EPCs活性、增殖、粘附、集落形成和衰老等功能的影響;其次我們研究了Tβ4對EPCs凋亡的作用,并探討了可能參與其中的信號轉導機制;最后我們還觀察了Tβ4對EPCs旁分泌作用的影響。以下分三部分對本研究的方法、結果及結論作一簡述。
第一部分:胸腺素β4對循環(huán)內皮祖細胞功能的影響。
5、 目的:觀察外源性Tβ4體外干預對循環(huán)EPCs功能的影響。
方法:采用密度梯度離心法從健康人外周血獲取單個核細胞,接種于人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板,培養(yǎng)7d后,采用激光共聚焦顯微鏡檢測FITC-UEA-I及DiI-acLDL雙染色鑒定EPCs,采用流式細胞儀檢測其表面標志(VEGFR-2,CD34,CD133),進一步鑒定EPCs。加入不同濃度Tβ4(1、10、100和1000ng/mL)干預不同時間后。分別采用MTT
6、比色法、Brdu細胞增殖試劑盒、粘附能力測定、集落形成實驗實驗和SA-β-半乳糖苷酶染色試劑盒觀察EPCs的活性、增殖、粘附、集落形成和衰老。
結果:Tβ4呈濃度依賴地增加EPCs的活性、增殖、集落形成和粘附能力,在1000ng/mL組達到最大效應(與對照組比較,細胞活性0.410±0.052vs0.264±0.035,P<0.05;增殖能力0.802±0.081 vs0.593±0.042,P<0.05;粘附能力44.4
7、±3.4 vs17.8±4.3,P<0.05;集落形成能力17.3±3.1 vs5.7±2.1,P<0.05)。此外,Tβ4干預還顯著抑制EPCs的衰老,且呈一定的量效關系,在1000ng/mL時達到最大效應(與對照組比較,20.67±3.06%vs45.33±3.51%,P<0.05)。
結論:Tβ4可增強EPCs的細胞活性、增殖和粘附等功能,同時抑制EPCs的衰老,且Tβ4對EPCs功能的作用具有一定的濃度依賴性。
8、r> 第二部分:胸腺素β4對循環(huán)內皮祖細胞凋亡的作用及機制。
目的:觀察Tβ4對循環(huán)EPCs凋亡的作用并探討其信號轉導機制。
方法:從健康人外周血分離、培養(yǎng)循環(huán)EPCs。細胞培養(yǎng)至7d后,采用去血清培養(yǎng)48h以誘導EPCs凋亡。加入不同濃度的Tβ4處理后,western blot檢測EPCsAkt/p-Akt Ser473、eNOS/p-eNOS Ser1177、PTEN/PTEN Ser380、JNK
9、/p-JNK、P38/p-P38和ERK1/2/p-ERK1/2等信號通路蛋白以及凋亡相關蛋白caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2和細胞色素C等凋亡相關蛋白的表達。隨后,在分別加入磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)抑制劑、內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)抑制劑、c-jun氨基末端激酶(c-junN-
10、terminal kinase,JNK)抑制劑等各種信號通路抑制劑預處理EPCs30min后,再予以1000ng/mL Tβ4干預24h,采用Annexin-V/PI凋亡檢測試劑盒檢測EPCs的凋亡率。
結果:Tβ4干預顯著抑制去血清誘導的EPCs凋亡和胞漿細胞色素C水平,且呈濃度依賴性。PI3K抑制(LY294002和Wortmannin)或JNK抑制劑SP600125能夠拮抗Tβ4的抗凋亡作用。此外,Tβ4還抑制了ca
11、spase-3、caspase-9的表達和活性,同時上調Bcl-2/Bax比值。Tβ4能夠在EPCs能與ILK形成免疫復合物,增加ILK的活性而不影響其表達。ILK-siRNA轉染后完全抑制Tβ4對ILK-Akt的激活,從而最終拮抗了Tβ4對EPCs凋亡的作用。
結論:Tβ4抑制去血清誘導的EPCs凋亡與ILK-Akt的激活有關,此外,JNK MAPK也可能參與了Tβ4對EPCs凋亡作用的調節(jié)。
第三部分:胸
12、腺素β4對循環(huán)內皮祖細胞旁分泌作用的影響。
目的:觀察Tβ4對循環(huán)EPCs旁分泌作用的影響。
方法:從健康人外周血分離、培養(yǎng)循環(huán)EPCs。EPCs條件培養(yǎng)液(EPCs-derivedconditioned medium,EPCs-CM)是循環(huán)EPCs用不含血清的EBM-2培養(yǎng)24h獲得。采用Ki-67免疫熒光檢測、Trans-well細胞遷移檢測和Martigel膠毛細血管樣結構形成分別檢測臍靜脈內皮細胞(H
13、uman umbilical vein endothelial cells,HUVECs)體外增殖、遷移和血管形成能力。熒光定量PCR檢測EPCs內VEGF、SDF-1、IGF-1、HGF-1、FGF-2、Tβ4和IL-8的表達。
結果:EPCs-CM能夠顯著增強內皮細胞增殖、遷移和毛細血管樣結構形成能力。Tβ4干預能夠進一步增強EPCs-CM對內皮細胞功能的影響。此外,Tβ4干預增加EPCs內VEGF、FGF-2、IL-
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