FGFR1對破骨細胞分化成熟與骨吸收功能的調控作用及機制研究.pdf

1、破骨細胞來源于骨髓單核.巨噬細胞系，多種細胞因子、激素和轉錄因子等通過調節(jié)成骨細胞分泌的破骨細胞分化因子(RANKL)、護骨素(OPG)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)的水平間接調控破骨細胞的分化和骨吸收活性。此外，降鈣素、雌激素和成纖維細胞生長因子(FGFs)等還直接作用于破骨細胞，通過調節(jié)相關信號通路分子的活性來直接調控破骨細胞的分化成熟和骨吸收活性。 FGFs是體內重要的信號調節(jié)分子，己發(fā)現(xiàn)多種FGFs(FGF2、FG

2、F9、FGF18和FGF23)可調控破骨細胞的分化和骨吸收功能。FGFs屬于分泌型蛋白分子，生物學效應需通過細胞膜上的成纖維生長因子受體(FGFRs)來實現(xiàn)，提示FGFRs參與了破骨細胞功能的調節(jié)。FGFR1是破骨細胞表達的主要FGFRs，成熟破骨細胞受FGF2刺激后，出現(xiàn)FGFR1的磷酸化水平上調，提示FGFR1在破骨細胞功能的直接調控中發(fā)揮重要作用，但缺乏直接證據(jù)。同時，F(xiàn)GFR1在成骨細胞中亦大量表達，已發(fā)現(xiàn)在早期成骨細胞條件性敲

3、除Fgfrl(用CollgenI-Cre)后會影響破骨細胞的分化和活性，提示FGFR1在破骨細胞功能的間接調控中也發(fā)揮重要作用，但其分子機制目前尚不清楚。此外，成骨細胞調控破骨細胞的能力受其分化程度影響，成年期間骨骼的成骨細胞以成熟的成骨細胞、特別是骨細胞為主，目前不清楚在成熟成骨細胞表達的FGFR1是否對破骨細胞的功能產(chǎn)生影響。 本課題利用在破骨譜系細胞和成熟成骨細胞條件性敲除Fgfrl的小鼠模型并結合體內外實驗，探討FGFR

4、1對破骨細胞的直接、間接調節(jié)作用及分子機制。主要內容包括兩部分：1.通過體內、外實驗探討FGFR1對破骨細胞的直接調控作用及機制；2.通過體外實驗探討FGFR1對破骨細胞的間接調控作用及機制。 主要實驗內容及方法如下： 第一部分：FGFR1對破骨細胞的直接調控作用及機制研究 動物分組：破骨譜系細胞條件性Fgfrl敲除小鼠(Lyzs-Cre；Fgfrlf/f)；對照小鼠(Fgfrlf/f)。 1.體內實驗：

5、 1)通過X-線攝像、藏紅/固綠(SO/FG)染色，分別在整體水平和組織水平觀察4月齡敲除小鼠和對照小鼠脛骨骨重建差異；通過抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色檢測骨重建過程中破骨細胞功能的變化。 2)利用4月齡敲除小鼠和對照小鼠建立脛骨不穩(wěn)定骨折模型，通過骨痂組織X-線攝像、SO/FG染色，分別在整體水平和組織水平觀察敲除小鼠和對照小鼠骨折愈合差異；通過TRAP染色觀察骨折愈合過程中破骨細胞功能的變化。 2.體外

6、實驗： 1)分離6w齡敲除小鼠和對照小鼠的骨髓單核細胞，利用RANKL和M-CSF進行破骨細胞誘導分化和骨吸收實驗。通過破骨細胞TRAP染色計數(shù)和骨吸收陷窩面積統(tǒng)計來觀察破骨細胞的分化和骨吸收活性。 2)提取誘導培養(yǎng)8d的破骨細胞總RNA和總蛋白，采用Real-TimePCR和Westernblot技術，檢測破骨細胞功能分子TRAP、Ctsk和MMP-9的表達水平及MAPK信號通路分子(p38、Erk和JNK)活化水平。

7、 第二部分：FGFR1對破骨細胞的間接調控作用及機制研究 動物分組：成熟成骨細胞條件性敲除小鼠(OC-Cre；Fgfrlf/f)；對照小鼠(Fgfrlf/f)。 1.成骨細胞增生凋亡檢測：利用新生敲除小鼠和對照小鼠的頭蓋骨分離成骨細胞，采用計數(shù)法繪制成骨細胞生長曲線，利用TUNEL法檢測成骨細胞凋亡。 2.成骨細胞中與破骨細胞功能相關分子檢測：提取培養(yǎng)第3代成骨細胞總RNA和總蛋白，利用Real-Time

8、PCR和Westernblot檢測成骨細胞中RANKL、OPG和M-CSF的表達及MAPK信號通路的活化水平。 3.共培養(yǎng)實驗：培養(yǎng)第3代敲除Fgfrl的成骨細胞和對照成骨細胞分別與野生小鼠骨髓單核細胞接種于同一培養(yǎng)皿中建立共培養(yǎng)模型。通過對共培養(yǎng)體系中破骨細胞TRAP染色計數(shù)和骨吸收陷窩面積統(tǒng)計來觀察共培養(yǎng)體系中破骨細胞的分化和骨吸收活性。 主要實驗結果： 一、FGFR1通過上調破骨細胞中Erk激酶的活性來促進

9、破骨細胞的的分化及骨吸收活性 1.4月齡敲除小鼠和對照小鼠脛骨骨組織形態(tài)無明顯差異，骨小梁破骨細胞數(shù)量及形態(tài)無明顯變化。骨折修復觀察則顯示：骨折10d，敲除小鼠和對照小鼠骨折愈合未見明顯差異。骨折愈合中后期(14d、21d和28d)，敲除小鼠的骨痂x線密度偏低，軟骨痂降解速度慢，骨折線消失遲緩，破骨細胞數(shù)量與鋪展面積亦明顯低于對照小鼠(P＜0.05)。提示，F(xiàn)GFR1不影響4月齡小鼠骨重建過程中破骨細胞的功能；但破骨譜系細胞條件

10、性敲除Fgfrl小鼠的骨折愈合延遲，愈合中后期破骨細胞的分化和活性均受抑制。 2.敲除小鼠骨髓單核細胞體外RANKL/M-CSF直接誘導形成的破骨細胞數(shù)量顯著減少(P＜0.05)，骨片上破骨細胞鋪展不佳，吸收陷窩面積明顯減小(P＜0.05)。分子檢測發(fā)現(xiàn)，敲除Fgfrl的破骨細胞中TRAP和MMP-9的表達顯著下調(P＜0.05)，MAPK信號通路成員Erk激酶的活化水平明顯下降(P＜0.05)。提示，F(xiàn)GFR1可能通過上調破骨

11、細胞中Erk激酶的活性及破骨細胞功能分子TRAP和MMP-9的表達來促進破骨細胞的分化及骨吸收活性。 二、FGFR1通過上調成骨細胞中M-CSF、下調OPG的表達來促進共培養(yǎng)體系中破骨細胞的分化和骨吸收功能 敲除Fgfrl的成骨細胞增生和凋亡明顯加快(P＜0.05)，成骨細胞中Erk和p38激酶的活性及M-CSF的表達化顯著下降(P＜0.05)，OPG表達則明顯上調(P＜0.05)。在敲除Fgfrl的成骨細胞與野生小鼠骨

12、髓單核細胞建立的共培養(yǎng)體系中，破骨細胞的數(shù)量及骨吸收陷窩面積均明顯小于對照(P＜0.05)。上述結果提示：FGFR1抑制成骨細胞的增生凋亡，上調成骨細胞中p38與Erk的活性及M-CSF的表達，抑制成骨細胞中OPG的表達，進而促進共培養(yǎng)體系中破骨細胞的分化與骨吸收活性。 主要結論： 1.4月齡破骨譜系細胞條件性敲除Fgfrl小鼠骨重建過程中破骨細胞功能無明顯變化；但FGFR1促進小鼠骨修復過程中破骨細胞的分化與骨吸收活性