Wnt3a-5a信號在TLR4調(diào)控MSC向成骨細胞分化成熟中的作用及機制研究.pdf

1、在適當條件下，MSCs能誘導(dǎo)分化成成骨細胞，在骨重建中發(fā)揮重要作用。既往文獻揭示在動物模型中骨髓來源MSCs能修復(fù)骨缺損。而且，MSCs多向分化潛能具有可塑性，MSCs還參與調(diào)控免疫反應(yīng)，其作用與其活化程度相關(guān)。
　　目的：
　　本實驗中，我們應(yīng)用TLR4配體LPS激活骨髓來源MSCs的TLR4，在體外研究TLR4激活對MSCs存活、增殖、成骨分化和細胞因子分泌的具體作用。另外，我們檢測TLR4激活過程中相關(guān)的Wnt信號，及

2、Wnt3a和wnt5a在TLR4誘導(dǎo)MSCs增殖、成骨分化和細胞因子分泌中的具體作用及機制。
　　方法：
　　1.從6至8周雄性野生型和基因敲除小鼠股骨、脛骨獲取骨髓細胞，培養(yǎng)體外野生型MSCs和TLR4基因敲除MSCs(TLR4-/-MSCs)，應(yīng)用流式細胞儀結(jié)合單克隆抗體CD29、CD44、CD31和CD45檢測細胞表面標志物鑒定MSCs;應(yīng)用PCR和電泳技術(shù)鑒定TLR4-/-MSCs中TLR4基因敲除是否成功。

3、　　2.應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測不同濃度LPS處理后MSCs的增殖作用。應(yīng)用AnnexinⅤ-FITC/PI染色和流式細胞儀檢測1000 ng/ml LPS對MSCs存活的影響。應(yīng)用CCK-8試劑盒在不同時間檢測相應(yīng)濃度LPS對MSCs增殖作用的影響。應(yīng)用EdU技術(shù)驗證LPS對MSCs增殖作用。
　　3.1000 ng/ml LPS處理后，在MSCs成骨分化培養(yǎng)3，5，7天，應(yīng)用ALP試劑盒檢測LPS處理后MSCs分化細胞中ALP

4、的活性變化，反應(yīng)成骨分化情況;1000 ng/mlLPS處理后，在MSCs成骨分化培養(yǎng)7，15，20，25天，應(yīng)用茜素紅染色檢測鈣沉積，反應(yīng)分化細胞成熟情況。
　　4.為了觀察LPS對MSCs分泌細胞因子的影響，1000 ng/ml LPS處理后MSCs培養(yǎng)3天。應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測LPS處理后MSCs中IL-6，IL-1β和TNF-α三種細胞因子mRNA水平，并應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測上清液中三種細胞因子蛋白水平

5、。
　　5.為了觀察LPS對TLR4受體的影響，1000 ng/ml LPS處理后MSCs培養(yǎng)3天。應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測MSCs中TLR4 mRNA水平，并應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測細胞膜上TLR4蛋白表達水平。
　　6.為了觀察TLR4缺失后LPS對MSCs增殖的影響，1000 ng/ml LPS處理后野生型MSCs和TLR4-/-MSCs分別培養(yǎng)6天。應(yīng)用CCK-8和EdU技術(shù)檢測TLR4-/

6、-MSCs增殖情況。
　　7.為了觀察TLR4缺失后LPS對MSCs成骨分化和成熟的影響，1000 ng/ml LPS處理后野生型MSCs和TLR4-/-MSCs分別骨向誘導(dǎo)培養(yǎng)3，5，7天，應(yīng)用ALP試劑盒檢測TLP活性。1000 ng/ml LPS處理后野生型MSCs和TLR4-/-MSCs分別骨向誘導(dǎo)培養(yǎng)7，15，25天，應(yīng)用茜素紅染色技術(shù)檢測鈣沉積情況。
　　8.為了觀察TLR4基因缺失后LPS對MSCs細胞分泌的影

7、響，1000 ng/ml LPS分別處理后野生型MSCs和TLR4-/-MSCs骨向誘導(dǎo)培養(yǎng)3天，應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)分別檢測IL-1β和IL-6 mRNA表達水平。
　　9.LPS處理MSCs后3天，應(yīng)用Real-time檢測Wnt3a、Wnt5a、Wnt6、Wnt10a和Wnt10b mRNA水平，篩選表達水平變化的Wnt。
　　10.分別在LPS處理MSCs1、2、3天，應(yīng)用Real-time PCR分別

8、檢測Wnt3a和Wnt5a mRNA表達變化情況，同時應(yīng)用ELISA技術(shù)分別檢測上清液中Wntt3a和Wnt5a蛋白變化情況，觀察LPS刺激對MSCs表達Wnt3a和Wnt5a的影響。
　　11.為了觀察TLR4基因缺失后LPS對Wnt3a和Wnt5a表達的影響，1000 ng/mlLPS分別處理后野生型MSCs和TLR4-/-MSCs培養(yǎng)1、2、3天，應(yīng)用Real-time PCR檢測Wnt3a和Wnt5a mRNA表達情況，應(yīng)

9、用ELISA檢測上清液中Wnt3a和Wnt5a蛋白水平。
　　12.基于RNA干擾技術(shù)，分別將特異性Wnt3a和Wnt5a siRNA轉(zhuǎn)染到MSCs內(nèi)。轉(zhuǎn)染后2、4天，應(yīng)用Real-time PCR分別檢測Wnt3a和Wnt5a mRNA的表達水平。
　　13.為了觀察Wnt3a和Wnt5a在LPS誘導(dǎo)MSCs細胞因子分泌中的作用，分別將Wnt3a或Wnt5a siRNA轉(zhuǎn)染到野生型MSCs內(nèi)。1000 ng/ml LPS處

10、理MSCs后培養(yǎng)2、4天，應(yīng)用Real-time PCR檢測IL-1β和IL-6 mRNA表達情況。
　　14.為了觀察Wnt3a和Wnt5a在LPS誘導(dǎo)MSCs增殖中的作用，分別將Wnt3a或Wnt5a siRNA轉(zhuǎn)染到野生型MSCs內(nèi)。1000 ng/ml LPS處理MSCs后培養(yǎng)6天，應(yīng)用CCK-8試劑盒和EdU技術(shù)檢測細胞增殖情況。
　　15.為了觀察Wnt3a和Wnt5a在LPS誘導(dǎo)MSCs成骨分化和成熟中的作用，

11、分別將Wnt3a或Wnt5a siRNA轉(zhuǎn)染到野生型MSCs內(nèi)。1000 ng/ml LPS處理MSCs后培養(yǎng)7天，應(yīng)用ALP試劑盒檢測MSCs分化細胞ALP活性。1000 ng/ml LPS處理MSCs后培養(yǎng)15天，應(yīng)用茜素紅染色技術(shù)檢測MSCs分化細胞成骨分化和成熟情況。
　　結(jié)果：
　　1.幾乎所有體外培養(yǎng)的野生型和TLR4-/-MSCs表面均表達CD29和CD44，而不表達CD31和CD45。在體外成功構(gòu)建了野生型M

12、SCs和TLR4基因敲除MSCs(TLR4-/-MSCs)模型，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。
　　2.1000 ng/ml LPS處理后6天，沒有發(fā)現(xiàn)細胞死亡增加。這說明濃度為1000 ng/ml的LPS對MSCs死亡沒有影響，不影響其存活，可作為后續(xù)實驗濃度。
　　3.LPS促進MSCs增殖，且與劑量和時間呈正相關(guān)。濃度為100和1000 ng/ml的LPS具有促進MSCs增殖的作用，1000 ng/ml作用更為明顯。LPS處理

13、后第2天開始MSCs增殖顯著增加，且隨著時間延長增殖作用更明顯。
　　4.LPS促進MSCs成骨分化和成熟。LPS處理后5，7天，分化細胞中的ALP活性明顯增加，提示LPS促進MSCs成骨分化。LPS處理后15天開始鈣沉積作用比對照組明顯增加，并隨時間延長增加更明顯，提示LPS促進MSCs分化細胞成熟。
　　5.1000 ng/ml LPS處理3天后，IL-6和IL-1β mRNA表達均上調(diào)。ELISA檢測同樣發(fā)現(xiàn)LPS處理

14、3天后培養(yǎng)液中IL-6和IL-1β蛋白量明顯增加。然而，LPS處理后TNF-α mRNA和蛋白均無明顯變化。
　　6.1000 ng/ml LPS處理3天后，TLR4 mRNA和蛋白水平均明顯上調(diào)。
　　7.LPS處理6天后TLR4-/-MSCs增殖無明顯影響。未處理的TLR4-/-MSCs和野生型MSCs之間增殖無明顯影響。這些結(jié)果提示LPS通過激活TLR4受體促進MSCs增殖;TLR4基因敲除沒有明顯抑制MSCs正常增殖

15、。
　　8.LPS處理7、15、25天后，TLR4-/-細胞分化后鈣沉積與對照組無明顯差別。LPS處理3、5、7天后，LPS組ALP活性物明顯差別。這些結(jié)果提示，LPS通過激活TLR4受體促進MSCs成骨分化與成熟。
　　9.TLR4基因敲除后，LPS促進MSCs分泌細胞因子作用消失，提示LPS通過激活TLR4受體促進MSCs分泌細胞因子。
　　10.培養(yǎng)液中Wnt3a和Wnt5a蛋白濃度隨時間延長明顯增加。
　

16、　11.LPS處理后，Wnt3a和Wnt5a mRNA在TLR4-/-MSCs中表達沒有明顯增加，提示LPS通過激活TLR4受體促進Wnt3a和Wnt5a表達。
　　12.Wnt3a和Wnt5a阻斷不影響LPS誘導(dǎo)MSCs分泌IL-6和IL-1β，提示W(wǎng)nt3a和Wnt5a不參與TLR4受體誘導(dǎo)的細胞因子分泌過程。
　　13.阻斷Wnt3a顯著抑制LPS對MSCs的增殖作用，Wnt3a在TLR4受體介導(dǎo)的MSCs增殖中發(fā)揮重

17、要作用，而Wnt5則在MSCs增殖過程中無明顯作用。
　　14.阻斷Wnt3a不影響LPS誘導(dǎo)的ALP活性和鈣沉積增加。Wnt5a參與TLR4受體介導(dǎo)的MSCs成骨分化與成熟，而Wnt3a則與MSCs成骨分化無明顯相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.LPS具有誘導(dǎo)骨髓來源MSCs增殖、成骨分化和細胞因子分泌的作用，當TLR4基因缺失時，LPS對MSCs的增殖、成骨分化和細胞因子分泌的作用消失。說明LPS通過激活TLR4受體促進

18、MSCs增殖、成骨分化和細胞因子分泌。
　　2.LPS能誘導(dǎo)野生型MSCs上調(diào)Wnt3a和Wnt5a水平，當TLR4基因缺失時，LPS上調(diào)Wnt3a和Wnt5a的作用消失。說明LPS通過激活TLR4受體誘導(dǎo)MSCs分泌Wnt3a和Wnt5a。TLR4受體通過上調(diào)Wnt3a表達水平促進MSCs增殖，通過上調(diào)Wnt5a表達水平促進MSCs成骨分化與成熟。而TLR4受體促進MSCs分泌細胞因子與Wnt3a和Wnt5a表達無關(guān)，可能存在另