重組腺病毒介導(dǎo)siBPR-Ⅱ抑制UHMWPE誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化成熟的作用.pdf

1、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、股骨頭壞死以及老年性髖部骨折等方面，已經(jīng)取得巨大成功，它能顯著改善患者的運(yùn)動功能和生存質(zhì)量。人工關(guān)節(jié)松動失效是術(shù)后嚴(yán)重的并發(fā)癥。近年研究發(fā)現(xiàn)，假體周圍產(chǎn)生的磨損顆粒，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞過度分化成熟，引起局部骨溶解是導(dǎo)致人工關(guān)節(jié)晚期無菌松動的最重要因素。防治術(shù)后無菌松動的關(guān)鍵即是抑制局部破骨細(xì)胞過度激活所引起的骨溶解效應(yīng)。最近幾年發(fā)現(xiàn)BMPs可直接或間接調(diào)控破骨細(xì)胞的分化成熟，使我們思考是否可以通過

2、RNA干擾技術(shù)沉默BMP受體，干擾BMP通路來抑制破骨細(xì)胞的分化成熟，因為它可以作用于破骨前體細(xì)胞本身，也可調(diào)控成骨細(xì)胞對破骨細(xì)胞的影響，這將對抑制破骨細(xì)胞的分化成熟起到雙管齊下的作用，這是其它靶點及信號通路所不具備的。
　　 目的：
　　 構(gòu)建重組腺病毒siRNA-BMPR-Ⅱ，觀察其在UHMWPE誘導(dǎo)溶骨的小鼠植骨氣囊模型中，抑制破骨細(xì)胞分化成熟及骨溶解的作用。并通過體外培養(yǎng)原代成骨細(xì)胞與原代破骨前體細(xì)胞，觀察siB

3、MPR是否具有抑制破骨前體細(xì)胞向具有溶骨作用的成熟破骨細(xì)胞分化的間接或直接調(diào)控作用。
　　 方法
　　 1.將選定的siBMPR-Ⅱ基因片段應(yīng)用到改良的AdEasy系統(tǒng)中，將siBMPR-Ⅱ基因片段克隆連接到pSES-HUS穿梭質(zhì)粒上，構(gòu)成pSES-HUS-siBMPR-Ⅱ質(zhì)粒。在基因測序后，正確的重組質(zhì)粒被Pmel酶線性化，與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1一起轉(zhuǎn)導(dǎo)到感受態(tài)細(xì)胞Escherichiacoii BJ5183中，

4、構(gòu)成pAd-siBMPR-Ⅱ質(zhì)粒。并通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝。測定病毒滴度，獲得攜帶siBMPR-Ⅱ的重組腺病毒。
　　 2.在體內(nèi)研究中，首先建立小鼠植骨氣囊聚乙烯顆粒（UHMWPE）誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的溶骨模型。通過real-time PCR、Western blot、破骨細(xì)胞TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）染色，相關(guān)蛋白免疫組織化學(xué)與免疫熒光等實驗方法，檢測各處理組局部破骨細(xì)胞數(shù)量及溶骨情況。觀察si

5、BMPR在體內(nèi)是否能抑制UHMwPE顆粒引起的破骨細(xì)胞過度分化成熟，減少局部溶骨的作用。
　　 3.體外實驗:原代成骨細(xì)胞與原代破骨前體細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立。A:原代成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與純化。B:原代破骨前體細(xì)胞分離與純化。
　　 (1)在原代破骨前體細(xì)胞培養(yǎng)體系中:
　　 通過檢測經(jīng)siBMPR處理過后破骨細(xì)胞形成的標(biāo)志性基因及蛋白的表達(dá)，以及破骨細(xì)胞的特殊染色（抗酒石酸酸性磷酸酶染色）觀察BMP信號通路直接調(diào)控

6、破骨細(xì)胞分化成熟的作用。
　　 (2)在原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)體系中:
　　 通過檢測經(jīng)siBMPR處理過后的成骨細(xì)胞RANKL、OPG的基因及蛋白表達(dá)情況，用以觀察siBMPR作用于破骨細(xì)胞分化成熟是否是通過間接調(diào)控作用。
　　 結(jié)果
　　 1.成功構(gòu)建表達(dá)siBMPR-Ⅱ的重組腺病毒。并通過real-time PCR，Western blot檢測，重組腺病毒siBMPR-Ⅱ可明顯減降破骨前體細(xì)胞BMPR-Ⅱ

7、基因與蛋白的表達(dá)。
　　 2.證實在UHMWPE誘導(dǎo)溶骨的小鼠植骨氣囊模型中，通過siRNA干擾BMPR-Ⅱ的表達(dá)，可以明顯抑制破骨細(xì)胞的分化成熟及骨的溶解。
　　 3.通過體外培養(yǎng)原代成骨細(xì)胞與原代破骨前體細(xì)胞，觀察得到siBMPR-Ⅱ可以直接抑制破骨前體細(xì)胞向具有溶骨作用的成熟破骨細(xì)胞的分化，以及調(diào)控成骨細(xì)胞OPG/RANKL的表達(dá)，間接抑制破骨細(xì)胞的分化成熟。
　　 結(jié)論
　　 本課題揭示了在磨損顆