Clara細(xì)胞10-kDa蛋白介導(dǎo)的呼吸道上皮細(xì)胞抗炎作用機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：Clara細(xì)胞10-kDa蛋白在呼吸道上皮細(xì)胞炎癥過程中的作用
　　 實(shí)驗(yàn)一、人CC10基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
　　 背景：慢性鼻-鼻竇炎和鼻息肉是呼吸道常見的慢性炎癥性疾病，它們的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。Clara細(xì)胞10-Kd蛋白（CC10）是具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的多功能蛋白質(zhì)。既往研究表明CC10在慢性鼻-鼻竇炎和鼻息肉組織中低表達(dá)，可能在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用

2、，但其具體作用機(jī)制尚未闡明。基因轉(zhuǎn)染是研究蛋白質(zhì)功能的重要手段，為研究CC10蛋白在呼吸道炎癥性疾病中的作用，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建人CC10真核表達(dá)載體，為下一步研究提供重要的幫助。
　　 目的：構(gòu)建及鑒定人CC10基因真核細(xì)胞表達(dá)載體。
　　 方法：采用RT-PCR法，從人下鼻甲組織的總RNA中擴(kuò)增含人CC10編碼區(qū)全長的Cdna片段，將其連接到pcDNA3.1/V5-His TOPO TA載體中，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CC10質(zhì)粒到支氣

3、管上皮細(xì)胞BEAS-2B，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法及Western blot法檢測CC10蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：用菌液PCR法和酶切鑒定質(zhì)粒并測序，人CC10基因成功克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1中，體外轉(zhuǎn)染CC10質(zhì)粒的BEAS-2B細(xì)胞中CC10蛋白表達(dá)明顯增高。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了CC10基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1-Hcc10，并獲得表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)二、Clara細(xì)胞10-kDa 蛋

4、白在呼吸道上皮細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用
　　 背景：Clara細(xì)胞10-Kd蛋白（CC10）是具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的多功能蛋白質(zhì)，既往研究表明CC10在呼吸道炎癥性疾病的發(fā)病過程中起重要作用。人類支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B細(xì)胞是廣泛被接受的用于研究呼吸道上皮細(xì)胞的模型，基因轉(zhuǎn)染是研究蛋白質(zhì)功能的重要手段。為研究CC10蛋白在呼吸道炎癥性疾病中的作用，本研究以細(xì)胞試驗(yàn)為模型，比較未轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)染了CC10質(zhì)粒的BEAS-2B細(xì)胞系對炎

5、性細(xì)胞因子的反應(yīng)，探討CC10在呼吸道炎癥性疾病中的作用。
　　 目的：用細(xì)胞因子IL-1β刺激BEAS-2B細(xì)胞建立呼吸道上皮細(xì)胞炎癥模型，并探討CC10蛋白能否在呼吸道上皮細(xì)胞系炎癥模型中起作用。
　　 方法：以細(xì)胞試驗(yàn)為模型，用pcDNA3.1或CC10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BEAS-2B細(xì)胞，48小時(shí)后再用炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1（IL-1β，10 ng/ml）作用6 h，采用實(shí)時(shí)定量（real-time）逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

6、（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測各組下游基因白細(xì)胞介素-8（IL-8）的變化。
　　 結(jié)果：IL-8在BEAS-2B細(xì)胞中基礎(chǔ)表達(dá)水平較低，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和CC10質(zhì)粒對IL-8的表達(dá)無影響，而與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的BEAS-2B細(xì)胞在IL-1β刺激6 h后IL-8 Mrna上調(diào)達(dá)150倍，刺激24 h后蛋白

7、上調(diào)達(dá)62倍，轉(zhuǎn)染CC10質(zhì)粒的BEAS-2B細(xì)胞明顯抑制IL-1β誘導(dǎo)的IL-8表達(dá)，其對Mrna和蛋白表達(dá)的抑制分別達(dá)5倍和2倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 結(jié)論：CC10可抑制IL-1β誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B IL-8 Mrna和蛋白的表達(dá)，CC10蛋白在呼吸道上皮細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用。
　　 第二部分：Clara細(xì)胞10-kDa 蛋白在呼吸道上皮細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制研究
　　

8、背景：Clara細(xì)胞10-Kd蛋白（CC10）是具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的多功能蛋白質(zhì)。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CC10在呼吸道上皮細(xì)胞可抑制IL-1β誘導(dǎo)BEAS-2B表達(dá)IL-8，但CC10在呼吸道發(fā)揮抗炎作用的具體機(jī)制還不清楚。IL-1β在呼吸道炎癥中可激活核轉(zhuǎn)錄因子Κb（NF-Κb），而IL-8基因的表達(dá)亦受NF-Κb的調(diào)控。因此我們推測CC10在呼吸道上皮細(xì)胞發(fā)揮的抗炎作用是通過抑制NF-Κb的活化來實(shí)現(xiàn)。
　　 目的：確定CC10

9、在呼吸道上皮細(xì)胞抑制IL-1β誘導(dǎo)BEAS-2B表達(dá)IL-8是否通過抑制NF-Κb的活性來介導(dǎo)，并闡明其作用機(jī)制。
　　 方法：采用報(bào)告熒光基因和Western blot方法，對CC10轉(zhuǎn)染的BEAS-2B細(xì)胞在加入IL-1β刺激后NF-Κb的活性變化進(jìn)行檢測，然后用Western blot方法檢測NF-Κb信號通路上游關(guān)鍵因子p-IκB-α和p-IKKα/β，最后用免疫共沉淀法檢測NF-Κb亞單位p65蛋白和CC10蛋白是否有

10、相互作用。
　　 結(jié)果：報(bào)告熒光基因檢測結(jié)果顯示BEAS-2B細(xì)胞在加入10 ng/ml的IL-1β作用4 h后NF-Κb的活性與空白對照相比上調(diào)達(dá)6.6倍，而轉(zhuǎn)染CC10質(zhì)粒后這種上調(diào)效應(yīng)被抑制，NF-Κb的活性明顯下調(diào)，達(dá)64.7%（P<0.05）。用Western blot方法分別檢測BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)總的p65在IL-1β刺激和轉(zhuǎn)染前后無變化，BEAS-2B細(xì)胞在IL-1β刺激后核內(nèi)p65蛋白迅速上調(diào)，而轉(zhuǎn)染CC10質(zhì)

11、粒后，核內(nèi)p65蛋白減少。進(jìn)一步檢測NF-Κb信號通路上游關(guān)鍵蛋白p-IκB-α和p-IKKα/β發(fā)現(xiàn)，CC10轉(zhuǎn)染后的BEAS-2B細(xì)胞與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在IL-1β作用后p-IκB-α減少，而p-IKKα/β的量則沒有變化。最后用免疫共沉淀法未發(fā)現(xiàn)CC10和p65蛋白間有直接作用。
　　 結(jié)論：CC10抑制IL-1β誘導(dǎo)BEAS-2B表達(dá)IL-8是通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子Κb來起作用，CC10抑制NF-Κb的活性的作用機(jī)制是抑制