Clara細胞10-kDa蛋白介導的呼吸道上皮細胞抗炎作用機制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：Clara細胞10-kDa蛋白在呼吸道上皮細胞炎癥過程中的作用
　　 實驗一、人CC10基因真核表達載體的構建及鑒定
　　 背景：慢性鼻-鼻竇炎和鼻息肉是呼吸道常見的慢性炎癥性疾病，它們的發(fā)病機制尚未完全闡明。Clara細胞10-Kd蛋白（CC10）是具有抗炎和免疫調節(jié)作用的多功能蛋白質。既往研究表明CC10在慢性鼻-鼻竇炎和鼻息肉組織中低表達，可能在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用

2、，但其具體作用機制尚未闡明。基因轉染是研究蛋白質功能的重要手段，為研究CC10蛋白在呼吸道炎癥性疾病中的作用，本實驗構建人CC10真核表達載體，為下一步研究提供重要的幫助。
　　 目的：構建及鑒定人CC10基因真核細胞表達載體。
　　 方法：采用RT-PCR法，從人下鼻甲組織的總RNA中擴增含人CC10編碼區(qū)全長的Cdna片段，將其連接到pcDNA3.1/V5-His TOPO TA載體中，脂質體法轉染CC10質粒到支氣

3、管上皮細胞BEAS-2B，免疫熒光細胞化學法及Western blot法檢測CC10蛋白的表達。
　　 結果：用菌液PCR法和酶切鑒定質粒并測序，人CC10基因成功克隆到真核細胞表達載體pcDNA3.1中，體外轉染CC10質粒的BEAS-2B細胞中CC10蛋白表達明顯增高。
　　 結論：成功構建了CC10基因的真核細胞表達載體pcDNA3.1-Hcc10，并獲得表達。
　　 實驗二、Clara細胞10-kDa 蛋

4、白在呼吸道上皮細胞中發(fā)揮抗炎作用
　　 背景：Clara細胞10-Kd蛋白（CC10）是具有抗炎和免疫調節(jié)作用的多功能蛋白質，既往研究表明CC10在呼吸道炎癥性疾病的發(fā)病過程中起重要作用。人類支氣管上皮細胞系BEAS-2B細胞是廣泛被接受的用于研究呼吸道上皮細胞的模型，基因轉染是研究蛋白質功能的重要手段。為研究CC10蛋白在呼吸道炎癥性疾病中的作用，本研究以細胞試驗為模型，比較未轉染與轉染了CC10質粒的BEAS-2B細胞系對炎

5、性細胞因子的反應，探討CC10在呼吸道炎癥性疾病中的作用。
　　 目的：用細胞因子IL-1β刺激BEAS-2B細胞建立呼吸道上皮細胞炎癥模型，并探討CC10蛋白能否在呼吸道上皮細胞系炎癥模型中起作用。
　　 方法：以細胞試驗為模型，用pcDNA3.1或CC10質粒轉染BEAS-2B細胞，48小時后再用炎性細胞因子白細胞介素-1（IL-1β，10 ng/ml）作用6 h，采用實時定量（real-time）逆轉錄聚合酶鏈反應

6、（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR），酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組下游基因白細胞介素-8（IL-8）的變化。
　　 結果：IL-8在BEAS-2B細胞中基礎表達水平較低，轉染空質粒和CC10質粒對IL-8的表達無影響，而與空白對照組相比，轉染空質粒組的BEAS-2B細胞在IL-1β刺激6 h后IL-8 Mrna上調達150倍，刺激24 h后蛋白

7、上調達62倍，轉染CC10質粒的BEAS-2B細胞明顯抑制IL-1β誘導的IL-8表達，其對Mrna和蛋白表達的抑制分別達5倍和2倍，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　 結論：CC10可抑制IL-1β誘導的支氣管上皮細胞BEAS-2B IL-8 Mrna和蛋白的表達，CC10蛋白在呼吸道上皮細胞中發(fā)揮抗炎作用。
　　 第二部分：Clara細胞10-kDa 蛋白在呼吸道上皮細胞發(fā)揮抗炎作用的機制研究
　　

8、背景：Clara細胞10-Kd蛋白（CC10）是具有抗炎和免疫調節(jié)作用的多功能蛋白質。前期試驗發(fā)現CC10在呼吸道上皮細胞可抑制IL-1β誘導BEAS-2B表達IL-8，但CC10在呼吸道發(fā)揮抗炎作用的具體機制還不清楚。IL-1β在呼吸道炎癥中可激活核轉錄因子Κb（NF-Κb），而IL-8基因的表達亦受NF-Κb的調控。因此我們推測CC10在呼吸道上皮細胞發(fā)揮的抗炎作用是通過抑制NF-Κb的活化來實現。
　　 目的：確定CC10

9、在呼吸道上皮細胞抑制IL-1β誘導BEAS-2B表達IL-8是否通過抑制NF-Κb的活性來介導，并闡明其作用機制。
　　 方法：采用報告熒光基因和Western blot方法，對CC10轉染的BEAS-2B細胞在加入IL-1β刺激后NF-Κb的活性變化進行檢測，然后用Western blot方法檢測NF-Κb信號通路上游關鍵因子p-IκB-α和p-IKKα/β，最后用免疫共沉淀法檢測NF-Κb亞單位p65蛋白和CC10蛋白是否有

10、相互作用。
　　 結果：報告熒光基因檢測結果顯示BEAS-2B細胞在加入10 ng/ml的IL-1β作用4 h后NF-Κb的活性與空白對照相比上調達6.6倍，而轉染CC10質粒后這種上調效應被抑制，NF-Κb的活性明顯下調，達64.7%（P<0.05）。用Western blot方法分別檢測BEAS-2B細胞內總的p65在IL-1β刺激和轉染前后無變化，BEAS-2B細胞在IL-1β刺激后核內p65蛋白迅速上調，而轉染CC10質

11、粒后，核內p65蛋白減少。進一步檢測NF-Κb信號通路上游關鍵蛋白p-IκB-α和p-IKKα/β發(fā)現，CC10轉染后的BEAS-2B細胞與空質粒轉染后的細胞在IL-1β作用后p-IκB-α減少，而p-IKKα/β的量則沒有變化。最后用免疫共沉淀法未發(fā)現CC10和p65蛋白間有直接作用。
　　 結論：CC10抑制IL-1β誘導BEAS-2B表達IL-8是通過抑制核轉錄因子Κb來起作用，CC10抑制NF-Κb的活性的作用機制是抑制