扶正增免方對樹突狀細(xì)胞生長及免疫活性的影響.pdf

1、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)被確認(rèn)為是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，是機體的哨位系統(tǒng)，具有啟動T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的功能，是體內(nèi)唯一能激活nalve T細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞”。與機體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，它能攝取各類抗原，在機體細(xì)胞免疫和體液免疫調(diào)控中均起著重要作用，且在腫瘤免疫治療中已顯示出其獨特的臨床應(yīng)用價值。
　　 研究表明，腫瘤誘導(dǎo)的

2、DC功能異常是腫瘤逃逸的主要機制之一，主要表現(xiàn)為功能完善的成熟DC(mature DC，mDC)的減少以及不成熟DC(immatureDC，iDC)在腫瘤局部的聚集，引起機體對腫瘤抗原的免疫耐受并促進腫瘤生長。
　　 激發(fā)DC細(xì)胞功能，采用DC細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療及腫瘤基因治療已經(jīng)是目前醫(yī)學(xué)界研究的熱門課題。20世紀(jì)90年代以來，人們在體外誘導(dǎo)擴增DC成功之后，克服了以往由于DC在組織中含量很少、難以獲取的困難，使DC研究取

3、得了許多突破性的進展。DC的發(fā)現(xiàn)和研究進展為中藥復(fù)方抗腫瘤免疫藥理研究提供了新的視角，即中藥復(fù)方抗腫瘤的免疫藥理學(xué)機制是否部分與影響腫瘤機體DC細(xì)胞增殖、成熟和表型及功能的改變有關(guān)
　　 近年來采用扶正增免方治療化療后的惡性血液病患者，臨床證明有減少感染，維持緩解，延緩復(fù)發(fā)，具有清除體內(nèi)微小殘留病灶，促進長期生存，提高生存質(zhì)量等作用。因此，我們希望通過進一步的體外實驗觀察其是否能增強對外周血樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)并使其活性增強，從一個

4、新的角度闡明其抗腫瘤的機理。
　　 本實驗參照Romani等分離培養(yǎng)DCs的方法，以無血清RPMI1640懸浮沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml，接種于六孔培養(yǎng)板(每孔4ml RPMI1640)，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2培養(yǎng)箱中溫育2小時，輕輕吸出非貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，分為實驗組與對照組，對照組加入GM-CSF及IL-4分別至終濃度1000U/ml和500U/ml，實驗組在此基礎(chǔ)上加扶正增免方制劑(設(shè)5個

5、濃度組：50ul/4ml、25ul/4ml、12.5ul/4ml、6.25ul/4ml、3.125ul/4ml)，于37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)，每3天補充半量新鮮培養(yǎng)液及相應(yīng)的細(xì)胞因子，第5天加用TNF-α100U/ml。
　　 在細(xì)胞培養(yǎng)過程中用倒置顯微鏡動態(tài)觀察細(xì)胞，必要時計數(shù)，并予攝像記錄。采用流式細(xì)胞術(shù)直接免疫熒光標(biāo)記法，在DCs培養(yǎng)的第7天收集細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，每管取懸液100ul，分別加入FITc

6、-標(biāo)記的CD1a、HLA-DR及PE標(biāo)記的CD86單抗各10ul直接染色，充分混勻后置室溫下暗室反應(yīng)15min。加PBS液，1000r/min，離心5min，洗滌后，以1％多聚甲醛固定備作流式細(xì)胞儀檢測，用Cell Quest軟件計算陽性細(xì)胞比率。并取培養(yǎng)第7天的DCs行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，通過MTT法比較各組的吸光度。
　　 結(jié)果顯示：在體外培養(yǎng)DCs時加入扶正增免方制劑(<25ul/4ml濃度時)對DCs的形態(tài)均無顯著影響；2

7、5ul/4ml、12.5ul/4ml，6.25ul/4ml、3.125ul/4ml的扶正增免方制劑干預(yù)的實驗組中細(xì)胞計數(shù)均比對照組高，且差異具有顯著性(P<0.05)。而50ul/4ml的中藥組中的細(xì)胞計數(shù)明顯減少。對照組及實驗組在細(xì)胞形態(tài)方面，除50ul/4ml濃度時鏡下觀察到從d4開始細(xì)胞減少，后期部分死亡，其余未見顯著差異。在對于各組DC免疫表型的檢測中，我們發(fā)現(xiàn)在扶正增免方制劑25ul/4ml濃度內(nèi)，對CD1a、CD86的表達(dá)，

8、有扶正增免方制劑干預(yù)的實驗組均高于等于對照組，且差異均有顯著性(P<0.05)，HLA-DR的表達(dá)兩組無顯著差異，幾乎均完全表達(dá)。但當(dāng)中藥濃度提高至50ul/4ml時，對CD1a、CD86、HLA-DR的表達(dá)卻表現(xiàn)出下降的趨勢。比較CD1a、CD86的流式檢測結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)25ul/4ml濃度內(nèi)，隨著扶正增免方制劑濃度的增加，DCs表面特異性標(biāo)志的表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)，而至50ul/4ml濃度時，這些表面特異性標(biāo)志的表達(dá)反而

9、是較前降低的，差異具有顯著性(P<0.05)。因此，從細(xì)胞數(shù)量以及流式細(xì)胞儀檢測DCs表面特異性標(biāo)志表達(dá)中，可以認(rèn)為扶正增免方制劑在25ul/4ml濃度內(nèi)在本實驗中可促進DCs的生長和成熟。
　　 在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Mixed Lymphocyte Reaetion，MLR)實驗中，扶正增免方制劑干預(yù)的DCs的吸光度(OD值)均高于未經(jīng)扶正增免方制劑干預(yù)的對照組，差異有顯著性(P<0.05)，并隨扶正增免方制劑劑量遞增，OD值

10、也呈遞增趨勢。其中12.5ul/4ml組扶正增免方制劑干預(yù)組的OD值就高于6.25ul/4ml組。其中又以刺激細(xì)胞(DCs)與反應(yīng)細(xì)胞(T細(xì)胞)比值為1:100時對扶正增免方制劑的干預(yù)最為敏感。
　　 本研究動態(tài)觀察了在外周血來源的DCs的體外培養(yǎng)中加入或不加扶正增免方制劑，DCs的形態(tài)與數(shù)量變化，以及在DCs成熟后其免疫活性的不同。通過上述實驗我們可以發(fā)現(xiàn)扶正增免方制劑不僅可以通過傳統(tǒng)的口服給藥來調(diào)節(jié)機體的免疫功能，而且，在體