腎癌混合多肽樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗體外免疫活性的研究.pdf

1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文腎癌混合多肽樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗體外免疫活性的研究姓名：樊長(zhǎng)暉申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：泌尿外科學(xué)指導(dǎo)教師：?jiǎn)瘫Ｆ?0050508鄭州大學(xué)2005年碩士學(xué)位論文腎癌混合多肽樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗體外免疫活性的研究至少有一個(gè)HLA相匹配的健康志愿者。3腎癌混合抗原多肽的獲得：采用細(xì)胞膜酸洗脫法，實(shí)驗(yàn)中采用細(xì)胞貼壁反復(fù)多次洗脫法。用PH33的磷酸檸檬酸緩沖液。收集生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786—0細(xì)胞，經(jīng)PBS液洗滌兩次后JX107細(xì)胞加

2、酸洗液5mL，室溫作用1分鐘，酸洗液1000rpm5分鐘離心，一20。C凍存，酸洗后的細(xì)胞經(jīng)PBS、培養(yǎng)液分別沖洗兩次后繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)后可再次酸洗。另一組786—0細(xì)胞用加ⅡN—Y2000u／111L的培養(yǎng)基培養(yǎng)，同法膜酸洗脫法獲得干擾素刺激后的抗原肽。分別獲得兩組不同的未經(jīng)純化的混合抗原多肽。4洗脫肽的純化：獲得的酸洗液經(jīng)SeppakC18去鹽柱去鹽，去鹽后真空冷凍干燥獲得蛋白混合物，用PBS溶液溶解蛋白混合物，后用Microco

3、nYM3管超過(guò)濾。濃縮和提取3000MW的肽混合物。20“C凍存。5DC的分離、誘導(dǎo)、負(fù)載抗原制備疫苗：利用篩選出的健康志愿者的外周血，應(yīng)用密度梯度離心法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)，用含hGMCSF1500u／mL，hlL4600u／mL及10％該健康志愿者血清的RPM]164037。C5％C02條件下培養(yǎng)，3h后換液除去非貼壁細(xì)胞。第5天根據(jù)DC數(shù)量以每1104個(gè)D

4、c加入5107細(xì)胞收獲的不同組分的肽，并加入脂多糖(1ipop01ysaccharide，LPS)5pg／mL，繼續(xù)培養(yǎng)24h，誘導(dǎo)Dc成熟，用兩組不同的混合抗原多肽刺激最終獲得了兩組混合多肽樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗。6腫瘤特異性細(xì)胞毒性(CTL)T淋巴細(xì)胞的體外誘導(dǎo)：獲得同一健康志愿者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，去除巨噬細(xì)胞后加入植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)刺激，用含hlL一2的RPMll640培養(yǎng)液培養(yǎng)，常規(guī)

5、培養(yǎng)PBMC4周，后收集純化的T細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞分別和兩組疫苗進(jìn)行培養(yǎng)、誘導(dǎo)，每7天應(yīng)用疫苗重復(fù)刺激淋巴細(xì)胞，共培養(yǎng)2l天。751Cr釋放法檢測(cè)CTL的殺傷活性，采用標(biāo)準(zhǔn)的4b“cr釋放法檢測(cè)CTL殺傷活性，以經(jīng)hlFN—y刺激獲得的多肽制備的疫苗誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞，未經(jīng)hlFN—y刺激獲得的多肽制備的疫苗誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞，腎癌抗原直接誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞，淋巴因子激活殺傷細(xì)胞(Lymphokineactivatedkillercell，LA