豬流行性腹瀉病毒對豬樹突狀細(xì)胞免疫功能的影響.pdf

1、豬流行性腹瀉(PED)的主要病原體是豬流行性腹瀉病毒(PEDV)，它主要引起仔豬的臨床病理特征是嘔吐、水樣腹瀉和脫水。各生長階段的豬均易感染PEDV，其中未斷奶仔豬的發(fā)病率高達(dá)100％，十日齡以內(nèi)的感染仔豬病死率為80％～100％。感染豬只雖然能夠存活，但是抵抗力下降，會導(dǎo)致其他相關(guān)疾病的混合感染。該病的爆發(fā)流行對畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。PEDV的主要靶器官是仔豬小腸上皮，而在仔豬小腸上皮下廣泛的分布著大量的樹突狀細(xì)胞(DCs)

2、，樹突狀細(xì)胞是目前已知的哺乳動物機體中功能最為強大的抗原遞呈細(xì)胞（APC），它不僅在監(jiān)視和抵御病毒入侵的過程中起到重要作用，同時還可以激活機體的抗病毒免疫應(yīng)答。本試驗以體外分離培養(yǎng)的豬單核源樹突狀細(xì)胞(Mo-DCs)和腸道樹突狀細(xì)胞為主要研究對象，通過體外試驗和體內(nèi)試驗驗證PEDV弱毒株CV777及其滅活毒與仔豬樹突狀細(xì)胞的相互作用，以此來探討PEDV弱毒株CV777及其滅活毒對仔豬樹突狀細(xì)胞主要免疫功能的影響，為研究PED的發(fā)病機制以

3、及PEDV疫苗的研制奠定理論基礎(chǔ)。
　　1.豬單核源DCs的體外分離培養(yǎng)和鑒定
　　DCs作為哺乳動物體內(nèi)功能最為強大的抗原遞呈細(xì)胞，是唯一能夠激活初始T細(xì)胞的一類異質(zhì)性細(xì)胞。它對于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、連接先天性免疫和獲得性免疫起到重要的紐帶作用。但是，DCs在機體中的含量是極少的，這對于DCs的研究十分不利。所以建立一套成熟的體外分離、誘導(dǎo)、培養(yǎng)豬DCs的方法模型就顯得十分重要。由于豬DCs沒有特異性的表面標(biāo)志，因此只能從分離得

4、到細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、相關(guān)表面分子的鑒定以及生物學(xué)活性三個方面綜合起來對分離培養(yǎng)出來的樹突狀細(xì)胞進行鑒定。結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的細(xì)胞有典型的樹突狀細(xì)胞形態(tài)，選取的表面分子:SWC3a+CD1a+、SWC3a+CD80/86+、SWC3a+SLA-Ⅱ-DR+的表達(dá)量分別可以達(dá)到58.95％、72.31％和13.39％，未成熟Mo-DCs經(jīng)LPS刺激24 h后可分化發(fā)育為成熟Mo-DCs，成熟Mo-DCs的SWC3a+CD1a+、SWC3a+CD8

5、0/86+、SWC3a+SLA-Ⅱ-DR+的表達(dá)量可以達(dá)到66.17％、81.16％和34.30％。同時在吞噬試驗中未成熟、成熟DCs的結(jié)果也符合DCs的相關(guān)生物學(xué)特性，這些結(jié)果均表明本試驗分離培養(yǎng)到了高純度的豬單核源DCs，可以進行下一步的試驗研究。
　　2.豬流行性腹瀉病毒及其滅活毒對體外培養(yǎng)的豬單核源樹突狀細(xì)胞免疫功能的影響
　　PEDV的主要靶組織是仔豬小腸上皮，而在仔豬小腸上皮下廣泛地分布著大量的DCs，DCs不僅

6、在監(jiān)視和抵御病毒入侵的過程中起到重要作用，同時還可以激活機體的抗病毒免疫應(yīng)答。為了探究PEDV及其滅活毒對豬DCs免疫功能的影響，我們用分離培養(yǎng)的仔豬單核源樹突狀細(xì)胞(Mo-DCs)與PEDV及其滅活毒共同作用，首先通過熒光定量和病毒滴度檢測PEDV對Mo-DCs細(xì)胞是否感染，再用流式細(xì)胞術(shù)和ELISA檢測PEDV及其滅活毒對選取的相關(guān)Mo-DCs細(xì)胞表面分子的表達(dá)量和細(xì)胞因子分泌量的影響，最后通過混合T淋巴反應(yīng)試驗驗證Mo-DCs在P

7、EDV及其滅活毒的作用下對T細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果表明，PEDV可以低水平感染未成熟、成熟Mo-DCs，并且未成熟Mo-DCs的易感性要高于成熟Mo-DCs;與對照組相比，PEDV及其滅活毒可以顯著的增加未成熟、成熟Mo-DCs表面分子CD1a+、CD80/86+和SLA-Ⅱ-DR+表達(dá)量;PEDV及其滅活毒可以使未成熟、成熟Mo-DCs分泌IL-12和IFN-γ顯著高于對照組;未成熟、成熟Mo-DCs在PEDV及其滅活毒的作用下能顯

8、著的刺激T細(xì)胞增殖。這些結(jié)果說明PEDV及其滅活毒可以顯著提高Mo-DCs的抗原遞呈、IL-12和IFN-γ的分泌以及刺激T細(xì)胞增殖的能力。
　　3.豬流行性腹瀉病毒弱毒株及其滅活毒對仔豬腸道樹突狀細(xì)胞免疫功能的影響
　　為了進一步驗證PEDV及其滅活毒對仔豬DCs免疫功能的影響，通過體內(nèi)試驗對體外試驗得到的結(jié)果進一步驗證。本試驗首先給仔豬進行腸結(jié)扎手術(shù)，向結(jié)扎腸段中注射PEDV及其滅活毒，通過免疫熒光和免疫組化的方法檢測不

9、同時間點仔豬小腸絨毛和固有層SWC3a+SLA-Ⅱ-DR+ DCs、CD11b+CD16+ DCs、CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量變化，從而驗證腸道DCs在PEDV及其滅活毒作用后免疫功能的變化情況。結(jié)果顯示:注射PEDV3 h后，仔豬腸道固有層SWC3a+SLA-Ⅱ-DR+ DCs和CD11b+CD16+ DCs數(shù)目顯著增加。48 h之后，仔豬腸道絨毛上SWC3a+SLA-Ⅱ-DR+DCs和CD11b+CD16+DCs數(shù)目顯

10、著增加。這說明在仔豬受到PEDV感染早期，腸道中的SWC3a+SLA-Ⅱ-DR+ DCs和CD11b+CD16+DCs會迅速經(jīng)固有層向腸系膜淋巴結(jié)遷移，并且在持續(xù)感染中，機體通過增加小腸絨毛DCs來增強遞呈抗原能力。而給仔豬注射PEDV及其滅活毒15 min、3h和48 h時間點，小腸絨毛、腸道固有層中的CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞相比對照組均呈現(xiàn)出顯著增加。這說明PEDV及其滅活毒可以通過增加腸道DCs遞呈功能而顯著刺激CD3+

11、、CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖能力。
　　為了進一步研究PEDV及其滅活毒對腸道DCs抗原遞呈功能的影響，本試驗給仔豬免疫PEDV及其滅活毒48 h后，用腸結(jié)扎手術(shù)向仔豬結(jié)扎腸段注射模式抗原-滅活大腸桿菌K88，用免疫熒光和免疫組化的方法檢測仔豬小腸絨毛和腸道固有層SWC3a+SLA-Ⅱ-DR+ DCs、CD11b+CD16+ DCs、CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)目變化。結(jié)果表明，注射滅活K883 h后，各組仔豬腸道絨

12、毛內(nèi)SWC3a+SLA-Ⅱ-DR+ DCs和CD11b+CD16+ DCs的數(shù)量減少，而各處理組的仔豬腸道固有層SWC3a+SLA-Ⅱ-DR+DCs和CD11b+CD16+ DCs數(shù)量顯著增加，這說明仔豬小腸絨毛中的DCs可能已經(jīng)向腸道固有層中進行遷移。而仔豬經(jīng)PEDV及其滅活毒免疫48 h后再注射滅活K8815 min和3h，各處理組中仔豬小腸絨毛和固有層內(nèi)CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量均呈現(xiàn)顯著增加。以上結(jié)果說明腸道樹突狀