Curcumin抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖-誘導(dǎo)其凋亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、采用大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(C6)和人膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞株(U87MG和LN229)，研究姜黃素(Curcumin)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的作用及分子機(jī)制。PTEN基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的、繼P53之后又一重要的抑癌基因，其突變率在膠質(zhì)細(xì)胞瘤中約占40％。Curcumin是否可以通過(guò)誘導(dǎo)野生型PTEN基因的表達(dá)而抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和／或促進(jìn)其凋亡，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。 方法：(1)MTT觀察Curcumin對(duì)C6細(xì)胞存活增殖的影響，通

2、過(guò)熒光標(biāo)記的BrdU抗體，顯微鏡下觀察Curcumin對(duì)C6細(xì)胞分裂增殖的影響。(2)碘化丙啶(propidiumiodide，PI)經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定Curcumin對(duì)C6細(xì)胞周期的阻滯。(3)用熒光染料AnnexinV-PE和7-AAD借助于流式細(xì)胞儀觀察Curcumin對(duì)C6細(xì)胞早期凋亡的影響；斷裂DNA凝膠電泳檢測(cè)Curcumin對(duì)C6細(xì)胞晚期凋亡的影響。(4)DCFDA熒光探針檢測(cè)Curcumin誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。(5)

3、RealtimeRT-PCR檢測(cè)Curcumin對(duì)基因mRNA表達(dá)的影響及westernblot檢測(cè)Curcumin對(duì)蛋白表達(dá)的影響。(6)gel-shift分析系統(tǒng)檢測(cè)Curcumin對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子KB和AP-1活性的影響。(7)將攜帶野生型PTEN基因的腺病毒載體感染不表達(dá)野生型PTEN基因的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG細(xì)胞后：觀察其對(duì)細(xì)胞存活、分裂增殖及凋亡的影響。(8)用PTEN的單克隆抗體預(yù)處理表達(dá)野生型PTEN基因的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株

4、LN229細(xì)胞、封閉其PTEN蛋白后，觀察Curcumin對(duì)細(xì)胞存活、分裂增殖及凋亡的影響。 結(jié)果：(一)在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，5、10、15、20、25、30lam的Curcumin與細(xì)胞作用24h后：MTT值呈劑量依賴性地顯著降低(P<0．01)；BrdU熒光標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少(與對(duì)照組比較，約減少了80％：P<0．01)；G1／S期細(xì)胞數(shù)量顯著增加、G2／M顯著減少(與對(duì)照組比較，Curcumin10、15pM時(shí)，G2

5、／M期的細(xì)胞已減至零，即細(xì)胞完全被阻滯在G1和S期，尤其是S期：P<0．01)；凋亡細(xì)胞明顯增加(與對(duì)照組比較，約增加了23％：P<0．01)；PTEN的基因(與對(duì)照組比較，約增加了6倍：P<0．01)和蛋白表達(dá)增加；iROS的產(chǎn)生明顯增加(與對(duì)照組比較，約增加了100％：P<0．01)；核轉(zhuǎn)錄因子ri3的活性增強(qiáng)、AP—l的活性降低；氧化應(yīng)激相關(guān)基因c—iun，HO一1和iNOS，細(xì)胞周期相關(guān)基因Cyc-D1，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因：APO

6、—1．FAF—l、Cas-3、Cas-8，腫瘤抑制基因p53的表達(dá)均增強(qiáng)(與對(duì)照組比較，這些基因的表達(dá)約增加了3—10倍以上：P<0．01)。(二)在U87MG細(xì)胞，轉(zhuǎn)染野生型PTEN基因后，PTEN基因的mRNA和蛋白表達(dá)以及蛋白活性均增強(qiáng)；MTT值降低(與對(duì)照組比較，約減少了50％：P<0．01)；BrdU熒光標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少((與對(duì)照組比較，約減少了60％：P<0．01)；細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加(與對(duì)照組比較，約增加了20

7、％：P<0．01)。(三)在LN229細(xì)胞，與細(xì)胞作用24h后：MTT值劑量依賴性地降低(P

8、瘤細(xì)胞：Curcumin能夠抑制細(xì)胞增殖、使細(xì)胞阻滯在G1／S期，并誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋亡；其作用機(jī)制可能與其上調(diào)PTEN基因、增加iROS的產(chǎn)生，進(jìn)一步影響核轉(zhuǎn)錄因子NF—KB和AP一1的活性、從而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。(二)在完全缺乏野生型PTEN基因的U87MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染野生型PTEN基因后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞分裂增殖明顯被抑制，而瘤細(xì)胞的凋亡率也明顯增加，進(jìn)一步支持野生型PTEN基因在抑制腦膠質(zhì)瘤中的重要作用和地位。(三)在表達(dá)野

9、生型PTEN基因的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN229，如果用單克隆抗體封閉PTEN蛋白后，再用Curcumin處理細(xì)胞，那么Curcumin抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用也明顯減弱。進(jìn)一步佐證了野生型PTEN基因上調(diào)可能是Curcumin抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡的重要分子機(jī)制。(四)Curcumin對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和凋亡均有顯著影響，且對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用比其誘導(dǎo)凋亡的作用更顯著，這種雙重影響可能是Curcumin顯著抗膠質(zhì)瘤