辣椒素對(duì)人子宮內(nèi)膜癌ISHIKAWA細(xì)胞的影響.pdf

1、背景：
　　子宮內(nèi)膜癌（Endometrial carcinoma, EC）是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮惡性腫瘤。近年來(lái)，我國(guó)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率逐年升高，居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位，目前僅次于宮頸癌，嚴(yán)重威脅女性健康。至今尚未找到有效預(yù)防和治療子宮內(nèi)膜癌的靶點(diǎn)。
　　辣椒素是高香草酸衍生物，是全世界廣泛應(yīng)用的蔬菜和香料辣椒中的主要活性成分。辣椒作為傳統(tǒng)藥物已有上千年歷史。辣椒素的外用膏藥已被用于臨床上治療皰疹性神經(jīng)痛、糖尿

2、病神經(jīng)病變患者疼痛和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者疼痛等。近年來(lái)，大量研究表明辣椒素在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中通過(guò)其受體TRPV1（transient receptor potential vanilloid1, TRPV1）依賴性或非依賴性途徑發(fā)揮抗癌作用。但是辣椒素在人子宮內(nèi)膜癌中的作用尚未見報(bào)道。
　　目的：
　　觀察不同人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系辣椒素受體TRPV1的表達(dá)情況，并探討分析辣椒素對(duì)TRPV1表達(dá)陽(yáng)性的人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系的

3、增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，以期為子宮內(nèi)膜癌的臨床治療提供新思路、新方法。
　　方法：
　　1細(xì)胞培養(yǎng)將人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系ISHIKAWA、HEC-1A、HEC-1B、KLE分別接種于含10％胎牛血清的DMEM/F12，DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2 Western免疫印跡檢測(cè)四種人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系的TRPV1表達(dá)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞提取蛋白，Western-Bl

4、ot檢測(cè)其TRPV1的表達(dá)情況。
　　3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) MTT法檢測(cè)辣椒素刺激后細(xì)胞增殖情況選取TRPV1表達(dá)陽(yáng)性的人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系，以不同濃度的辣椒素刺激不同時(shí)間，MTT法檢測(cè)其體外增殖情況。
　　4流式細(xì)胞檢測(cè)分析流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)辣椒素刺激后細(xì)胞凋亡率和周期分布
　　細(xì)胞凋亡檢測(cè)：常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞至70%融合時(shí)，加入不同濃度辣椒素刺激，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)后，分別收集細(xì)胞。用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次，離心棄上清，用含Ann

5、exin V-FITC和PI染色液室溫避光條件下孵育，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　細(xì)胞周期檢測(cè)：常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞至70%融合時(shí)，加入不同濃度辣椒素刺激，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)后，分別收集細(xì)胞。70%的乙醇固定，4℃過(guò)夜， PBS清洗后重懸，含RNA酶的PI染液37℃孵育30分鐘，送檢。
　　5統(tǒng)計(jì)分析：所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三遍，數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。采用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)統(tǒng)計(jì)圖制作，

6、所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用One-way ANOVA分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1 TRPV1蛋白在人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中的表達(dá)：ISHIKAWA細(xì)胞系表達(dá)TRPV1蛋白，而HEC-1A，HEC-1B，KLE細(xì)胞系均未檢測(cè)到TRPV1蛋白表達(dá)。
　　2辣椒素對(duì)ISHIKAWA細(xì)胞增殖活性的影響：隨著辣椒素刺激濃度的增高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，ISHIKAWA細(xì)胞的增殖活性逐漸下降，辣椒素對(duì)體外培

7、養(yǎng)的ISHIKAWA細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且具有濃度和時(shí)間依賴性。
　　3辣椒素對(duì)ISHIKAWA細(xì)胞凋亡率影響：ISHIKAWA細(xì)胞經(jīng)0、200和400μmol/L辣椒素處理24 h后，細(xì)胞凋亡率分別為：16.08±7.96%、60.93±2.99%、75.18±3.18%，其中早期凋亡比例分別為8.15±3.80%、54.02±6.46%和50.39±15.08%，晚期凋亡比例為7.93±7.60%、6.91±3.62%、2

8、4.79±13.36%，藥物處理組總體凋亡率較對(duì)照組明顯升高，且有濃度依賴現(xiàn)象，差異具有顯著性（F=98.861，P=0.000），進(jìn)一步分析顯示ISHIKAWA細(xì)胞凋亡主要集中在早期，200和400μmol/L辣椒素處后早期凋亡率均明顯升高，且與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=20.642, P=0.002），而晚期凋亡較對(duì)照組升高不明顯（F=2.209, P=0.191），總的來(lái)說(shuō)，辣椒素可明顯誘導(dǎo)ISHIKAWA細(xì)胞凋亡，隨著凋亡率

9、的增加，活細(xì)胞所占比例也顯著減少。
　　4辣椒素對(duì)ISHIKAWA細(xì)胞周期分布的影響：分別以0、200和400μmol/L辣椒素處理24 h后，ISHIKAWA細(xì)胞周期分布如下：G0/G1期細(xì)胞比例分別為53.84±3.04％、59.43±2.69％和70.95±0.79％；S期細(xì)胞分別為26.38±8.32％、14.81±3.23％和20.48±1.84％；G2/M期細(xì)胞分別為
　　19.78±7.53％、15.76±3.

10、23％和8.57±1.28％，即藥物處理組G0/G1期細(xì)胞所占比例較對(duì)照組明顯增加，且差異具有顯著性（F=7.950, P=0.021）。
　　結(jié)論：
　　1人子宮內(nèi)膜癌ISHIKAWA細(xì)胞系表達(dá)TRPV1蛋白，而HEC-1A、HEC-1B和KLE人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系均未檢測(cè)到TRPV1蛋白表達(dá)。
　　2辣椒素可抑制體外ISHIKAWA細(xì)胞的增殖。
　　3辣椒素可誘導(dǎo)體外ISHIKAWA細(xì)胞凋亡。
　　4辣椒